申翰欽
摘? 要:新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck orthoreovirus,NDRV)在番鴨和北京鴨上流行,引起番鴨的肝斑狀出血和北京鴨的脾壞死。本研究從廣東云浮某養(yǎng)殖場發(fā)生以肝臟出血為病變的番鴨中分離到一株NDRV,命名為GD-YF-202001。對GD-YF-202001株的σC基因進行RT-PCR擴增、克隆測序與序列分析。結果顯示,分離株σC基因與NDRV SDJN18毒株同源性最高,遺傳距離較近;分離株σC氨基酸序出現(xiàn)多個氨基酸位點突變,發(fā)生了較大的變異。
關鍵詞:新型鴨呼腸孤病毒;NDRV;分離鑒定;σC基因;進化分析
新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck orthoreovirus,NDRV)屬于呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬成員,基因組由10個雙鏈RNA片段組成。NDRV感染番鴨主要引起肝臟斑狀出血和壞死,感染北京鴨主要引起脾壞死等癥狀[1,2]。NDRV感染能引起免疫器官,因此被認為是鴨群重要的免疫抑制病,發(fā)病日齡在5~25 d左右,死亡率為5%~50%,且發(fā)病日齡越小,死亡率越高[2,3]。近年來,該病在山東、河南、河北、安徽、遼寧、福建、廣東等地均有發(fā)生,嚴重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展[4,5]。
本研究于2020年從廣東云浮某養(yǎng)殖場出現(xiàn)典型肝臟斑狀出血癥狀的番鴨病料中分離到一株NDRV,并對σC基因測序及遺傳進化分析,以探究分離株的生物學特性,以期為NDRV流行病學調(diào)查積累數(shù)據(jù),為該病防控提供參考依據(jù)。
1? 材料與方法
1.1? 臨床樣品采集與病毒分離? 發(fā)病番鴨群死淘率約20%,病死鴨剖檢可見肝斑狀出血。采集發(fā)病鴨只的肝臟和脾臟組織,剪碎,加入5倍量PBS以及2000 IU/mL的青霉素、鏈霉素研磨成糜狀,移入滅菌離心管中,在4 ℃的冰箱中放置3 h后,反復凍融3次,8000 rpm離心5 min,取上清接種Vero細胞和DEF細胞,37 ℃培養(yǎng)3~5 d,待超過50%細胞出現(xiàn)CPE后凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2? RT-PCR檢測? 取1.1中收集的細胞上清,按照HiPure Viral RNA/DNA Kit試劑盒說明書提取病毒RNA。使用TaKaRa公司PrimeScriptTM One-Step RT-PCR試劑盒進行σC基因擴增(上游引物:5′- GCATGCAATGGTGGTACAGTG -3′;下游引物:5′- CTTACTGCGTGACATGGACC -3′)[4],反應條件為:50 ℃ 30 min;94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s,53 ℃ 40 s,72 ℃ 60 s,共進行35個循環(huán);72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物,回收目的片段,克隆至pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化至Dh5α感受態(tài)細胞,陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。
1.3? σC基因測序與分析? 用DNAStar軟件對分離株與參考毒株σC基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列進行同源性分析。使用MEGA-7軟件鄰位相接法構建進化樹。
2? 結果
2.1? 病毒分離鑒定? 臨床病料分別接種Vero和DEF細胞,培養(yǎng)3~5 d,細胞出現(xiàn)融合、裂解等典型的CPE,見圖1。細胞上清液RT-PCR檢測結果顯示NDRV陽性。分離毒株命名為GD-YF-202001株。
2.2? σC基因測序與分析? 測序獲得σC基因長966 bp的開放性閱讀框,編碼321個氨基酸殘基。對獲得的序列進行同源性分析,結果顯示分離株與NDRV SDJN18株同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分別為96.3%和96.0%;與NDRV代表毒株TH11和091核苷酸同源性分別為94.1%和95.0%,氨基酸同源性分別為95.3%和95.0%,見表1。
2.3? 氨基酸序列變異分析? GD-YF-202001株σC氨基酸序列發(fā)生多個位點的突變,主要在第200(G→D)、207(I→T)、223(M→L)、255(M→L)、289 (S→T)、298(A→V)、300(V→I)、304(S→P)、310(Q→R)位氨基酸,見圖2。這些氨基位點的突變與獨立的相關性需要進一步的研究。
2.3? 遺傳進化分析? 遺傳進化分析結果表明,GD-YF-202001株與NDRV SDJN18株和SDHZYC株遺傳距離較近,但與SDJN18所在的Clade II分支仍有一定的遺傳距離,形成獨立的分支。NDRV代表毒株TH11和091屬于Clade I分支,由進化樹可見,GD-YF-202001株介于Clade I與Clade II之間,見圖3。
3? 討論
NDRV在國內(nèi)分布廣泛,番鴨、半番和白鴨均易感,能引起較高的死亡率,嚴重威脅我國水禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。目前尚未有商品化的疫苗用于該病的預防,做好生物安全措施是防控該病的重要手段,特別是做好孵化場消毒工作,避免鴨群從孵化場感染帶毒。NDRV感染可導致免疫抑制,容易引起細菌性疾病的繼發(fā),且繼發(fā)感染后抗生素治療效果較差,造成嚴重的經(jīng)濟損失。
本研究從廣東云浮某養(yǎng)殖場發(fā)生肝臟斑狀出血癥狀的番鴨群中分離到1株NDRV,該毒株感染Vero和DEF細胞引起典型的CPE[6],在DEF細胞上毒價可達108 TCID50/mL,提示鴨呼腸孤病毒具有廣泛的細胞嗜性。σC基因進化分析發(fā)現(xiàn)該毒株處于Clade I和Clade II之間,氨基酸序列發(fā)生多個位點突變。這些突變位點位于病毒表面,集中在200~310位氨基酸之間,突變是否與毒力相關還需要進一步研究。
參考文獻:
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[2]? 黃瑜,蘇敬良,施少華,等. 我國鴨呼腸孤病毒感染相關的疫病[J].中國獸醫(yī)雜志,2009,45(07):57-58.
[3]? Wang H, Gao B, Liu X, et al. Pathogenicity of a variant duck orthoreovirus strain in Cherry Valley Ducklings[J]. Veterinary Microbiology, 2020, 242: 108546.
[4]? Cao Y, Sun M, Wang J, et al.Phenotypic and genetic characterisation of an emerging reovirus from Pekin ducks in China[J].Scientific Reports, 2019, 9(1):478-484.
[5]? Wang H, Gao B, Chen H,et al.Isolation and characterization of a variant duck orthoreovirus causing spleen necrosis in Peking ducks, China[J]. Transboundary and Emerging Diseases,2019,66(5):2033-2044.
[6]? 羅丹,高立,孟照潔,等. 新型鴨呼腸孤病毒的分離鑒定及其σC基因遺傳進化分析[J].中國預防獸醫(yī)學報,2020,42(05):445-450.