宋延靜，馬蘭，李萌，付嬈，梁曉艷，張海洋，王向譽，郭洪恩

(山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺 264002)

微生物是全球生物地球化學(xué)循環(huán)的驅(qū)動者[1-2]，微生物介導(dǎo)的土壤氮循環(huán)對全球生態(tài)系統(tǒng)意義重大[3]，其中的固氮過程能夠?qū)⒋髿庵械牡獨膺€原成氨和其他含氮化合物，為河口地區(qū)提供初級生產(chǎn)力。黃河三角洲是中國重要的后備土地資源，也是典型的河口濕地生態(tài)系統(tǒng)和生態(tài)敏感地帶。在全球變化背景下，進一步揭示該地區(qū)微生物尤其是植物根際微生物驅(qū)動的氮循環(huán)過程，對評價與預(yù)測河口濕地生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能與管理決策的變化至關(guān)重要。

蘆葦作為能夠在鹽漬化環(huán)境下生存的典型常見鹽生植物，主要生長在河口濕洼地和濱海沼澤地等地勢低洼的地區(qū)。研究表明，蘆葦在濕地系統(tǒng)的氮素降解過程中起著重要作用。YARWOOD等[4]對北美濕地地區(qū)的兩類蘆葦根際細菌和古菌群落結(jié)構(gòu)進行研究，結(jié)果表明不同蘆葦間蘆葦根際細菌的豐度和群落結(jié)構(gòu)不存在差異，而古菌的分布卻存在顯著性差異。LIU等[5]對北京翠湖濕地的蘆葦根際古菌進行研究，發(fā)現(xiàn)其蘆葦根際古菌主要來源于廣古菌門和泉古菌門，同時還存在較多未知菌群。BORRUSO等[6]在對蘆葦根際群落結(jié)構(gòu)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)Desulfosalsimonas是內(nèi)蒙古烏梁素海鹽池內(nèi)地區(qū)蘆葦根際的主要微生物類群，同時發(fā)現(xiàn)鹽度是影響此地區(qū)蘆葦根際微生物群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子。總而言之，國內(nèi)外有關(guān)蘆葦根際微生物的研究主要集中于16S、18S基礎(chǔ)之上的細菌、真菌研究[7-8]，而對根際功能微生物研究較少[9]，尤其是對黃河三角洲濕地蘆葦根際固氮菌的研究。

結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)與高通量測序技術(shù)，本研究首次對黃河三角洲不同地域的蘆葦根際固氮微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)進行比較分析，詳細了解黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際固氮菌分布的差異,不同生境下土壤理化性質(zhì)與固氮菌群落結(jié)構(gòu)和豐度相互關(guān)聯(lián)的影響因素,旨在為理解鹽漬化背景下土壤-微生物-植物互作機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 土壤樣品采集

在黃河三角洲區(qū)域依次到昌邑、壽光、濱州、東營4個采樣站(圖1) 進行蘆葦資源的調(diào)查及其蘆葦根際土壤的采樣。在采集根際土?xí)r首先要采集包含植物根系的土壤，對于質(zhì)地松散的土壤，采用抖土法抖掉與根系松散結(jié)合的土壤，采用小刷將與根系緊密結(jié)合的土壤刷下來，作為根際土。采集后存于冰盒(4 ℃)并立即轉(zhuǎn)移到實驗室，用于提取DNA的樣品后立即放置到-80 ℃冷凍，用于測定環(huán)境因子的樣品放到-20 ℃。

圖1 黃河三角洲地區(qū)采樣點圖

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

pH值的測定：土壤樣品利用0.01 mol·L-1氯化鈣溶液進行浸提。m(水)∶m(土)= 5∶1，經(jīng)充分攪拌，平衡30 min，用pH值計測定。

土壤含鹽量的測定：土壤樣品利用0.01 mol·L-1氯化鈣溶液進行浸提。m(水)∶m(土)= 5∶1，經(jīng)充分攪拌，平衡 30 min，用電導(dǎo)率儀測定。

土壤中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量測定：土樣經(jīng)冷凍干燥后，2.5 g 土中加入 25 mL 2 mol·L-1的KCl，振蕩1 h，過濾備用，采用連續(xù)流動分析儀(AutoAnalyzer III)測定。

土壤總氮含量的測定：土樣經(jīng)冷凍干燥后過 100 目的篩子，用錫紙包樣，利用元素分析儀(Vario Micro cube) 進行測定。

土壤中Na+和K+含量測定：稱取5 g風(fēng)干后土壤，加入25 mL去離子水，震蕩過濾后利用原子吸收分光光度儀(島津AA-7000)進行測定。

1.3 土壤DNA的提取和高通量測序

每個根際土壤樣品稱取0.5～1.0 g，利用Fast DNA?SPIN Kit for Soil (Bio 101，Carlsbad，CA)，按照試劑盒要求說明步驟提取土壤中微生物DNA。提取的 DNA 分裝后用分光光度計(NanoDrop2000c)測定DNA 的濃度及純度。利用固氮菌引物polF(5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′)/polR(5′-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3′)[10]進行PCR擴增，然后利用Illumina PE250測序平臺進行測序(上海凌恩生物有限公司)。

1.4 熒光定量PCR

固氮菌的絕對豐度采用TB Green熒光定量PCR法獲得，在BioRad CFX96 平臺上進行。反應(yīng)體系(20μL)：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各 0.8 μL，樣品模板 DNA 1 μL，ddH2O 7.4 μL。固氮菌熒光定量PCR的擴增引物為反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；最后按照BioRad CFX96實時熒光定量檢測系統(tǒng)默認程序制備熔解曲線：95 ℃ 5 s，65 ℃至95 ℃(每個循環(huán)增加0.5 ℃)5 s，檢測是否存在非特異性擴增。稀釋相應(yīng)的質(zhì)粒濃度從10-1到10-8，并最終繪制標(biāo)準曲線。每個樣品設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)不加模板的反應(yīng)管為陰性對照。

1.5 高通量數(shù)據(jù)分析

高通量數(shù)據(jù)分析基于Linux 平臺的QIIME 1.9.0 流程，參考數(shù)據(jù)庫為FGR(version:7.3)。具體流程如下：過濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基和質(zhì)控后50 bp以下的read；篩除錯配比率大于0.2的拼接序列；用Usearch軟件和gold數(shù)據(jù)庫，采用denovo和reference結(jié)合的方式去除嵌合體，并選取97%的序列相似度作為閾值(cut off)劃分 OTU；采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用 SPSS 20 統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)檢驗不同地域蘆葦根際土中nifH基因拷貝數(shù)的差異是否顯著；利用mothur計算不同地域蘆葦根際固氮菌的α多樣性指數(shù)；利用R語言的vegan包進行基于UniFrac的聚類樹分析，應(yīng)用CANOCO軟件中的典型對應(yīng)分析(CCA)探索固氮菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境變量之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤環(huán)境因子分析

表1 環(huán)境因子測定結(jié)果

2.2 固氮菌豐度比較及與環(huán)境因子相關(guān)性

定量PCR結(jié)果(圖2)顯示，來源于黃河三角洲4個采樣點的蘆葦根際土壤中nifH基因拷貝數(shù)存在顯著差異(P<0.001)，其中東營地區(qū)蘆葦根際土中nifH基因拷貝數(shù)平均值為1.31×108copies·g-1；濱州地區(qū)蘆葦根際土中nifH基因拷貝數(shù)平均值為9.47×107copies·g-1；壽光地區(qū)蘆葦根際土中nifH基因拷貝數(shù)平均值為1.59×106copies·g-1，昌邑地區(qū)蘆葦根際土中nifH基因拷貝數(shù)平均值為2.39×106copies·g-1，具體表現(xiàn)為東營>濱州>昌邑>壽光。與根際土相比，蘆葦根周土中的固氮菌豐度在昌邑、壽光、東營3個采樣帶差異不顯著，只有來源于濱州采樣點的蘆葦根際土中nifH基因拷貝數(shù)顯著高于根周土(5.64×107copies·g-1，P=0.006)。

利用SPSS軟件對蘆葦根際固氮菌豐度與環(huán)境因子進行Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)蘆葦根際固氮菌豐度與土壤含鹽量(ρ=0.964，P=0.036)和含水量顯著正相關(guān)(ρ=0.986，P=0.014)，與其他環(huán)境因子相關(guān)性不顯著。

2.3 黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際固氮菌的α多樣性

通過質(zhì)控，共獲得169 582 條高質(zhì)量的nifH基因序列，劃分為1 577個OTU， 每個采樣點蘆葦根際固氮菌的OTU數(shù)量平均在279～839之間，固氮菌的α多樣性指數(shù)(OTU 數(shù)目、豐富度指數(shù)Chao1、多樣性香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù))在濱州采樣點最高，昌邑采樣點最低。從表2的Chao數(shù)據(jù)可知，各樣本的微生物豐富度排序為：濱州>東營>壽光>昌邑；從Shannon 指數(shù)來看，各站點微生物多樣性從高到低依次是：濱州>東營>壽光>昌邑。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表2 不同采樣點蘆葦根際固氮微生物α多樣性指數(shù)

2.4 黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際固氮微生物群落組成分析

從圖3中門的水平來看，所有蘆葦根際固氮菌中，變形桿菌門(Proteobacteria)占據(jù)絕對優(yōu)勢(54.4%～86.0%)，只是不同采樣點的類型不同。其中在濱州采樣點的蘆葦根際中，γ-型變形菌綱(29.3%)豐度最高，同時也存在δ-變形菌綱(19.6%)，β-變形菌綱(14.0%)和α- 變形菌綱(10.7%)；昌邑采樣點的蘆葦根際土中，α-變形菌綱(49.7%)和β-變形菌綱(20.0%)占主導(dǎo)；東營蘆葦根際土中，δ-變形菌綱(33.6%)和γ-型變形菌綱(32.6%)豐度最高；壽光蘆葦根際土中，主要的固氮菌類型為α-變形菌綱(27.1%)和β-變形菌綱(19.0%)，但變形菌門不是壽光蘆葦根際土中的核心類群，藍細菌門是壽光蘆葦根際的主要固氮菌類群(Cyanobacteria，30.8%)。除藍細菌外，放線菌門(Actinobacteria)也僅在壽光的采樣點含量較豐富。厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)、綠菌門(Chlorobi)在濱州的蘆葦根際豐度較高。廣古菌門(Euryarchaeota)在東營、濱州采樣點豐度要顯著高于昌邑、壽光。

從圖4屬的水平可以看出，濱州采樣點蘆葦根際固氮菌中占優(yōu)勢的菌屬分別為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium，9.28%)、脫磷孤菌屬(Desulfovibrio，9.00%)以及固氮弧菌屬(Azoarcus，10.6%)，昌邑蘆葦根際固氮菌占優(yōu)勢的菌屬為農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium，32.7%)，東營蘆葦根際固氮菌占優(yōu)勢的菌屬為慢生根瘤菌屬(16.1%)，壽光采樣點蘆葦根際固氮菌占優(yōu)勢的菌屬為固氮螺菌屬(Azospirillum，18.8%)以及魚腥藻屬(Anabaena，17.9%)，其中魚腥藻屬僅在壽光、昌邑蘆葦根際有發(fā)現(xiàn)。

圖3 黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際固氮菌群落熱圖(門級別)

2.5 蘆葦根際固氮微生物在黃河三角洲的空間分布差異及環(huán)境影響因子

由圖5可看出，黃河三角洲蘆葦根際固氮菌群被分為4大分支，第一分支包含第二分支和壽光蘆葦根際，第二分支包含第三分支和昌邑蘆葦，第三分支包含東營蘆葦和濱州蘆葦。結(jié)合樣本在樹狀圖中的位置以及樹狀圖中樹枝長度可知，東營和濱州蘆葦根際固氮菌群落組成以及結(jié)構(gòu)差異較小，壽光蘆葦根際固氮菌群落結(jié)構(gòu)與其他樣本的差異性較大。

典型對應(yīng)分析(CCA,圖6)發(fā)現(xiàn)黃河三角洲區(qū)域蘆葦根際固氮菌的群落結(jié)構(gòu)受總氮(P=0.05)、含水量(P=0.08)、Na+含量(P=0.16)的影響較大。第一軸解釋率為47.2%,第二軸解釋率為36.6%。

3 結(jié)論與討論

3.1 黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦生境特征

蘆葦是黃河三角洲地區(qū)常見的一種鹽生植物，在昌邑、壽光、東營、濱州等鹽漬化地區(qū)均有分布[11]。對4個采樣點的土壤分析結(jié)果顯示，4個采樣點pH值相近，都屬于弱堿性土壤，肥力較低，無機氮(氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮總和)含量在2.78到14.05 mg·kg-1之間，遠遠低于耕地的氮水平[12-13]。東營和濱州采樣點的鹽漬化程度最高，且均為黏土。壽光和昌邑采樣點土壤屬砂質(zhì)土，雖然屬于濱海鹽土范疇，但含鹽量不高。濱州、壽光地區(qū)的總碳、總氮含量均高于昌邑、壽光采樣點，土壤營養(yǎng)成分相對較高。

圖4 黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際固氮菌群落結(jié)構(gòu)(屬級別)

圖5 基于UniFrac的蘆葦根際固氮菌聚類樹分析

3.2 蘆葦根際固氮菌在黃河三角洲不同地區(qū)的空間分布特征

本研究發(fā)現(xiàn)，黃河三角洲地區(qū)蘆葦根際固氮菌的豐度存在空間分布差異，東營、濱州兩個采樣點的蘆葦根際固氮菌豐度顯著高于昌邑、壽光。在黃河三角洲不同地區(qū)的蘆葦根際中，變形桿菌門(Proteobacteria)始終占據(jù)絕對優(yōu)勢(54.4%～86.0%)，分析黃河三角洲濕地土壤pH值為7.18～7.58，說明變形桿菌門、藍菌門、厚壁菌門在該pH范圍內(nèi)可以生長，而變形桿菌成為黃河三角洲濕地中主要固氮微生物的原因可能與其對鹽堿地的適應(yīng)性更強有關(guān)。脫磷孤菌屬(Desulfovibrio)是濱州蘆葦根際的優(yōu)勢菌株，此類群也被蘭鴻珠等研究為艾比湖濕地地區(qū)蘆葦非根際土壤土壤中的優(yōu)勢固氮類群[14]，脫硫孤菌屬是一種主要分布在淡水、淡咸水、海水的沉積物中的革蘭氏陰性菌，屬于硫酸鹽還原菌，有科研人員從潮間帶微生物席上也得到該硫酸鹽還原細菌菌株[15]，這可能跟濱州蘆葦所處土壤環(huán)境含水量較高有關(guān)。固氮螺菌屬(Azospirillum)和魚腥藻屬(Anabaena)是壽光地區(qū)蘆葦根際的主要固氮菌類群，壽光地區(qū)固氮螺菌屬是一種具有固氮作用的根際聯(lián)合固氮菌[16]。慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)是東營和濱州兩地蘆葦根際的優(yōu)勢菌屬。

黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際土中鑒定出很多尚未培養(yǎng)或未知種屬的固氮菌，揭示了蘆葦根際固氮菌多樣性及種類的龐大。多樣性與其生態(tài)穩(wěn)定性密切相關(guān)，黃河三角洲濱海濕地生境中蘆葦根際固氮菌的多樣性一定程度上表明蘆葦?shù)纳鷳B(tài)適應(yīng)性以及較為完整的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。總體來講，黃河三角洲不同采樣點下蘆葦根際土壤中的微生物群落在門水平上有一定的穩(wěn)定性，其核心微生物群落結(jié)構(gòu)只是在含量上發(fā)生改變．通過β多樣性分析濱州和東營間細菌群落組成以及結(jié)構(gòu)差異較小，壽光與其他樣本的差異性較大。研究表明地理距離是影響細菌群落分布的重要因素[17]，本研究與此結(jié)論一致。

圖6 黃河三角洲不同地區(qū)蘆葦根際固氮菌群落結(jié)與環(huán)境因子的典型對應(yīng)分析

3.3 黃河三角洲蘆葦根際固氮菌豐度、群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境響應(yīng)

由于固氮菌在土壤氮循環(huán)功能中占有重要位置，對濱海濕地鹽生植物根際固氮菌多樣性及分布規(guī)律的認識有助于進一步理解此環(huán)境氮循環(huán)的微生物學(xué)機制。本研究結(jié)果說明固氮菌在黃河三角洲蘆葦根際廣泛存在，多樣性較高；不同地區(qū)的蘆葦根際固氮菌豐度和群落結(jié)構(gòu)分布存在差異，總氮、含水量、含鹽量等環(huán)境因子是調(diào)控黃河三角洲地區(qū)蘆葦根際固氮菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的最重要環(huán)境因子。接下來可從時間、生態(tài)位的跨度方面對黃河三角洲蘆葦根際固氮菌的群落分布進行進一步研究。