楊亞濤，李冬賢，彭曾，王順，馬劉正，張浩，邵理陽，胡建東,5

(1.河南農(nóng)業(yè)大學機電工程學院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)激光技術國際聯(lián)合實驗室，河南 鄭州 450002； 3.南方科技大學電子系，廣東 深圳 518000； 4.河南農(nóng)業(yè)大學理學院，河南 鄭州 450002； 5.小麥玉米作物學國家重點實驗室，河南 鄭州 450002)

光學表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)傳感作為現(xiàn)代傳感技術中的一個方向，利用其高靈敏度、高精確度、快速響應的優(yōu)勢已經(jīng)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、醫(yī)學等領域中得到廣泛應用[1-2]。光纖作為一種微納米尺度下的特殊波導結構，具有高速傳輸、快速響應、信息融載量大等特點，光纖SPR是通過光束在纖芯與包層界面處發(fā)生全反射，由于界面折射率的變化導致相速度與群速度的差異，泄露的倏逝波攏動起沉積在光纖表面的金屬內(nèi)部自由電子振蕩，這種自由電子的集體運動按特定頻率以表面等離子體波( surface plasmon wave，SPW )的形式出現(xiàn)，周圍環(huán)境介質(zhì)改變將會影響光纖的有效折射率及SPW傳播損耗[3-5]，通過觀測光纖表面等離子體共振頻率的變化可以得到傳感信號。光纖SPR傳感器生物傳感器具有微量檢測、小型化、抗電磁干擾等優(yōu)點，避免了傳統(tǒng)棱鏡SPR傳感檢測系統(tǒng)的復雜性[6-7]。當?shù)入x激元金屬尺寸遠小于入射波長時，在一定頻率電磁波的誘導下，金屬表面極化方向上會出現(xiàn)較強的局域電場，即局域表面等離子共振( localized surface plasmon resonance,LSPR )，這種效應具有定向光場傳輸、局部熱點和共振耦合增強等優(yōu)勢[8-9]，其傳感檢測技術已在生物小分子探測領域展開應用[10]。當2個納米金屬相互靠近組成相鄰結構且在2個金屬之間形成納米量級的間隙時，腔等離激元共振在納米間隙傳播并被激發(fā)出不同模式[11-12]，金屬粒子與金屬薄膜形成納米間隙后可以激發(fā)出數(shù)倍的增強電場，同時出現(xiàn)等離激元共振的近場模式和遠場模式[13]，應用這種效應可以將光子晶體光纖SPR傳感靈敏度提高至3 915 nm·RIU-1[14-15]。

在生物傳感中，生物識別分子是直接接觸生物樣品的傳感單元，作為生物識別分子的一種，核酸適配體是一段具有特殊功能的寡核苷酸鏈 (單鏈DNA 或 RNA)，相比于生物抗體識別傳感，其對目標物具有高親和力及高特異性，具有分子量小、無免疫原性、易修飾等諸多無可比擬的優(yōu)點[16]。AuNPs與核酸適配體結合的LSPR生物傳感器[17]，是利用核酸適配體與目標物特異性結合時，借助于核酸分子之間能夠形成氫鍵、范德華力或通過堿基互補配對原則等能夠折疊成特定的二級和三級結構。作為一種小分子物質(zhì)，植物激素脫落酸 ( abscisic acid,ABA )的分子式為C15H20O4，相對分子質(zhì)量為264.3，是一種調(diào)節(jié)植物生長的微量有機物質(zhì)，它能抑制種子萌發(fā)、調(diào)節(jié)氣孔開閉和促進休眠。ABA在植物體內(nèi)具有的重要作用使其成為農(nóng)業(yè)生物學研究的一大熱點，研究人員通過研究植物體內(nèi)ABA含量變化，來分析植物的抗逆過程[18-19]。利用光學傳感方法檢測ABA，具有快速分析的優(yōu)勢；針對SPR傳感技術檢測ABA，已開展的研究有通過在金膜表面偶聯(lián)ABA抗體，實現(xiàn)了ABA的間接檢測[20]；也有利用LSPR的光譜分析方法，通過金納米顆粒偶聯(lián)ABA的核酸適配體也提高了檢測效率和實現(xiàn)生物試劑的可重復利用[21]。為創(chuàng)建一種高效準確、快速靈敏的ABA新檢測方法，本研究提出一種光纖表面等離子體共振生物傳感器的設計方案，并利用核酸適配體功能化的納米顆粒實現(xiàn)對植物激素ABA的檢測。

1 光纖SPR傳感模型

當自由耦合進光纖的入射光在沿著軸向傳播時，光束在纖芯-包層界面處發(fā)生全反射，激發(fā)表面金屬薄膜內(nèi)自由電子振蕩，在波長為λ0處完成表面波矢匹配，完成誘導光纖表面等離子體共振效應。作者提出在光纖表面附著金納米顆粒的共振增強傳感結構，這種傳感器結構旨在形成Au-AuNPs的局域納米腔，當金屬薄膜表面附著納米金屬顆粒后，被激發(fā)的等離子體模式電場在顆粒結構的作用下出現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移和局域電場增強，此時光纖外部環(huán)境折射率發(fā)生Δn的變化時，光纖SPR響應光譜發(fā)生Δλ移動。作者通過有限元算法模擬附著單個納米顆粒的光纖SPR傳感結構，如圖1所示。考慮到后期實驗使用的塑料包層光纖是以其纖芯作為傳感區(qū)，仿真結構采用40 μm直徑的全芯光纖，纖芯折射率為1.458，纖芯外層為40 nm金膜，設定其周圍是折射率可變的介質(zhì)環(huán)境，同時在金膜上方10 nm處放置10 nm粒徑的金納米球，金的折射率參考Drude模型[22]。

圖1 附著單個納米顆粒的光纖SPR傳感模型及截面電場分布

當環(huán)境折射率RI為1.35，入射波長為595 nm時，光纖TM基模的電場分布如圖1-b所示，該傳輸模式下的光束能量主要分布在纖芯內(nèi)部，靠近包層區(qū)域的能量衰減明顯，但在金膜與介質(zhì)邊界處的電場發(fā)生了明顯變化，該波長下激發(fā)出的金屬等離子體共振模存在于光纖邊緣外側(cè)。圖2-a顯示了光纖邊界納米顆粒的局域電場分布，受金膜表面等離子體影響，金納米顆粒表面電場強弱分布明顯，在其上下極化方向存在電場增強，即為局域等離子體模式，這種模式由于納米顆粒的尺寸遠小于表面等離子體波的亞波長傳輸范圍，有利于兩者的能量轉(zhuǎn)移、模式耦合；當納米顆粒外圍環(huán)境的折射率發(fā)生變化時，局域等離子體模式電場發(fā)生改變，進一步影響光纖傳輸模式的有效折射率neff和光強透射率(T)如式(1)表示[23]，

(1)

式中：λ為入射光波長，imag(neff)為模式有效折射率，L為光纖傳感區(qū)長度。

在該傳感結構下，光強透射率與環(huán)境折射率的變化關系如圖2-b所示。光透射曲線以波谷的形式出現(xiàn)，在谷底位置金屬電子振蕩最強烈，此處為等離共振波長；通過檢測不同環(huán)境的共振波長響應可以得到環(huán)境介質(zhì)的傳感信息，隨著環(huán)境折射率的升高，透射率曲線整體發(fā)生紅移，共振波長也逐漸增大，在不同折射率環(huán)境的共振波長數(shù)值見表1。在高折射率環(huán)境下，SPR傳感效果更加明顯且靈敏度更大。根據(jù)靈敏度(S)計算公式(2)，可以得到波長隨折射率變化的趨勢，即靈敏度S隨折射率增大而增大，從折射率1.33～1.34的靈敏度1 500 nm·RIU-1，增大到1.36～1.37附近的4 500 nm·RIU-1，相比于傳統(tǒng)SPR和LSPR的傳感結構，光纖SPR傳感結構具有高靈敏度的傳感優(yōu)勢。

圖2 光纖邊界納米顆粒的局域電場分布及隨環(huán)境折射率變化的透射曲線

表1 光纖SPR傳感器在不同折射率下的共振波長

(2)

式中：Δλ為共振波長的變化量，Δn為相對折射率的變化增量。

2 光纖SPR傳感試驗

2.1 傳感器制備

為獲得更強的SPR共振信號，選取大芯徑塑料包層光纖(plastic cladding fiber,PCF)，通過去除其塑料包層的操作便可得到仿真中的全芯光纖結構；硬塑料包層在試驗測試中具有良好穩(wěn)固性和保護纖芯不被損壞，400 μm的光纖芯徑滿足了其與商用光纖之間的光耦合，同時金的等離子體共振波長也在其光束傳播范圍。在塑料包層光纖SPR傳感器的制備過程中，主要考慮2個步驟：首先，制作無包層的全芯光纖基底，隨后，在光纖表面生長沉積一定納米量級的金屬薄膜。圖3顯示了塑料包層光纖SPR傳感器的制作流程。

圖3 塑料包層光纖SPR傳感器的制備流程

制作光纖基底時，截取50 mm長度的塑料包層光纖，在距離其端面10 mm處用刻蝕刀劃繞并使劃痕逼近石英纖芯；將10 mm以下區(qū)域的塑料包層完全浸潤在丙酮溶液中30 min，經(jīng)過丙酮浸泡柔化后塑料光纖的塑料包層和石英纖芯分離，用光纖鉗刮去被浸潤過的塑料包層，使石英纖芯裸漏在環(huán)境中，通過化學清洗保證其表面平整無污染；在真空鍍膜環(huán)節(jié)，采用電子束蒸發(fā)鍍膜的方式在處理過的纖芯基底蒸鍍納米厚度的金膜，為了提高金膜的表面附著力，按照研究經(jīng)驗先在基底上涂敷2 nm的金屬鉻，再在鉻金屬表面蒸鍍48 nm的金膜，金屬層厚度累計為50 nm，真空電子束熱蒸發(fā)鍍膜儀(英國HHV，TF500 )可以實現(xiàn)多層蒸鍍，鍍膜腔室晶振實時監(jiān)測鍍膜厚度；為保證反射信號不受外界干擾，用3 000、5 000目的砂紙打磨光纖的兩端平面，保證端面與軸向的垂直性和端面的整潔性，隨后用無水乙醇(分析純)對其進行超聲清洗；將另一端面插入SMA906光纖接頭并固定，至此塑料光纖SPR傳感器制作完成，已制備的傳感樣品在圖4中顯示。

2.2 傳感測試

如圖4所示，試驗檢測系統(tǒng)的搭建由光譜儀(Ocean Optics,Maya 2000+)、鹵素燈(Ocean Optics,UV-Vis 360～2 000 nm)、600 μm纖芯直徑的Y型光纖、SFA906法蘭盤和已制備的塑料包層光纖SPR傳感器組成。鹵素燈發(fā)出的光束經(jīng)過600 μm光纖傳輸后耦合進SPR光纖傳感器，在其末端發(fā)生鏡面反射后返回Y型光纖輸出端，反射光束信號被光譜儀接收，并以透射率T映射SPR共振響應信號，透射率T計算公式為：

(3)

式中：IS為樣品溶液環(huán)境的光譜值，IA為空氣背景的光譜值，I0為暗背景(噪聲)光譜值。

圖4 光纖SPR傳感檢測系統(tǒng)

圖5顯示了不同環(huán)境下反射光束的原始光譜，IA為空氣背景的光譜值(空氣背景的相對折射率為1)，IS1為去離子水環(huán)境的光譜值(去離子水環(huán)境折射率為1.333 2)，當傳感器放入液態(tài)環(huán)境，光譜響應信號在可見光波長范圍內(nèi)變化明顯，隨著傳感器環(huán)境折射率的升高，反射光束能量在500～800 nm處出現(xiàn)衰減，通過公式(3)計算得水介質(zhì)的透射率TS1，透射光譜以吸收峰的形式出現(xiàn)，并在574.4 nm附近共振吸收最強。為驗證制備的光纖SPR傳感器的傳感效果，添加折射率為1.337 8環(huán)境的乙醇溶液(1.5 mol·L-1)，IS2為此環(huán)境的光譜值，其透射光譜曲線TS2的最大吸收波長在581.2 nm處，可得到傳感器的共振光譜響應變化是隨折射率增大而發(fā)生紅移，這種靈敏度變化趨勢符合模擬計算結果，在折射率1.333 2～1.337 8范圍的平均波長靈敏度為1 478.26 nm·RIU-1，溶液環(huán)境下具有較高的傳感靈敏度，有利于實現(xiàn)生物傳感。

圖5 光纖SPR傳感器在空氣、水環(huán)境的原始光譜、透射光譜

3 生物傳感分析

核酸適配體的長單鏈結構具有A、T、C、G不同堿基，堿基中N原子與Au原子通過形成Au-N配位鍵從而使核酸適配體包裹在游離的金納米顆粒表面，形成核酸適配體官能團化的納米顆粒，同時與目標物特異性結合時，借助于核酸分子之間能夠形成氫鍵、范德華力或通過堿基互補配對原則等能夠折疊成特定的結構，將生物分子與納米顆粒發(fā)生反應。核酸適配體與ABA發(fā)生相互作用時，核酸適配體折疊成四聚體結構，具有較高的親和性。作者以核酸適配體功能化的納米顆粒為識別探針，對微量低濃度的ABA溶液展開傳感測試。

3.1 ABA檢測方案

在識別探針的制備中，首先以巰基化的光纖SPR傳感器為基底，使光纖表面形成牢固的Au-B-AuNPs局域納米腔結構，這里的B代指物理支撐或者化學生物偶聯(lián)的結構,隨后再用核酸適配體將納米顆粒進行功能化包覆。局域納米腔結構的形成中，可以采用二硫蘇糖醇( Dithiothreitol,DTT )偶聯(lián)金膜和金納米顆粒，一方面，DTT兩端同時具有H-S巰基， Au與巰基可以很容易形成Au-S鍵，這種化學鍵穩(wěn)定性強；另一方面，DTT是一種兩端對稱的化學結構，在與其他物質(zhì)連接時可以保持結構直立，鏈長控制在5 nm范圍，能夠有效保證局域場的共振耦合的效果[24]。

具體方案如圖6所示，利用DTT連接AuNPs，使其在光纖SPR探針表面形成局域納米腔，加入過量的AuNPs使得光纖傳感器的金薄膜上方形成一層致密的金屬顆粒膜，這種腔結構可以提高光纖SPR的傳感靈敏度；隨后將ABA的核酸適配體包裹在AuNPs表面，整體上呈現(xiàn)出Au-S-S-AuNPs-Aptamer的多層自組裝膜結構，當加入目標分析物ABA后，ABA與核酸適配體特異性結合，誘導核酸適配體構象發(fā)生變化，形成G-四聚體結構，剛性增強從顆粒表面解離下來，進而改變AuNPs周圍環(huán)境，通過光纖SPR共振波長的變化來進一步確定ABA試劑的含量，試驗所涉及到的相關材料試劑詳情見表2。

圖6 脫落酸的光纖傳感方案

表2 試驗中相關材料及化學試劑的相關參數(shù)

3.2 附著納米顆粒分析

采用構建的光纖SPR傳感系統(tǒng)測試不同濃度的納米顆粒共振信息，以粒徑10 nm、質(zhì)量濃度0.05 mg·mL-1的AuNPs溶液為底液，完成不同摩爾濃度的AuNPs溶液配比，獲取的AuNPs溶液濃度為5、10、15、20、25 mmol·L-1，并實行等體積滴定測試，每種濃度AuNPs溶液樣品參與傳感檢測的體積均為10 μL。

試驗步驟如下：1.制備5種不同濃度的AuNPs溶液，并將溶液振蕩均勻后靜置；2.取60 μL DTT試劑(500 mmol·L-1)后加940 μL去離子水，將DTT試劑配成30 mmol·L-1濃度；3.用去離子水浸潤已制備的塑料光纖SPR傳感器，保證金膜表面無污染；4.連接好光譜檢測設備，記錄暗背景下的噪聲信號以及空氣亮背景下的光譜信號，再次朝塑料光纖探針的傳感區(qū)域滴加10 μL的去離子水，保存其響應光譜，同時參考空氣背景及去離子水背景下的信號對傳感器光譜進行歸一化校正；5.分別向不同檢測組的傳感器探針里滴入30 μL的DTT試劑(30 mmol·L-1濃度),這個容量足以在塑料光纖的鍍金膜面形成牢固的Au-S鍵；6.2 h后用去離子水清洗探針表面，并記錄其光譜信號；7.隨后向各組滴加相應濃度的AuNPs溶液，體積均為10 μL，并記錄其光譜信號；8.2 h后用去離子水充分清洗探針表面，并記錄去離子水環(huán)境下的光譜信號。

進一步討論在光纖SPR傳感器表面附著不同量的AuNPs所產(chǎn)生的傳感信息，將上述光譜信息進行透射率計算得到圖7-a，表示生長完6種不同濃度下的AuNPs在去離子水介質(zhì)中的透射光譜。隨著光纖表面AuNPs附著數(shù)量的增加，共振峰出現(xiàn)明顯紅移，共振損耗也隨著增大，這是由于Au-AuNPs結構下產(chǎn)生的局域表面共振耦合，導致共振光譜信息變化，具體共振波長數(shù)值見表3。在圖7-a的小圖中也顯示了5種不同濃度下的AuNPs溶液的合成顏色，分散良好的 AuNPs 為淺紅色，低濃度下均顯示為淡粉色，顏色視覺差別不大。從圖7-b的SEM圖可以看出，塑料光纖表面出現(xiàn)明顯的納米顆粒附著，同時由于Au-AuNPs的鏈接使得金膜表面形成一層致密的金屬顆粒薄膜。相較于金顆粒團聚的吸收峰方法[21]，光纖SPR傳感器偶聯(lián)AuNPs的形式，更有利于檢測低濃度、小粒徑的顆粒物信息。

圖7 SPR傳感器在水溶液附著納米顆粒的透射光譜及光纖表面附著顆粒的SEM圖

表3 傳感器滴定不同濃度在水溶液的共振波長

3.3 ABA傳感分析

根據(jù)圖6顯示的脫落酸濃度測試方案，需要將納米顆粒適配體功能化，在光纖表面形成Au-AuNPs結構的基礎上，添加ABA適配體。試驗步驟如下：1.將光纖SPR傳感器置于水中觀測未形成AuNPs層的透射光譜，以此校對傳感器；2.取足量的DTT試劑(500 mmol·L-1)浸沒已制備的傳感器約90 min，保證金膜表面完全偶聯(lián)DTT，在光纖表面形成Au-S-S結構，并檢測偶聯(lián)后的光譜信號；3.去離子水清洗過后，取足量的AuNPs溶液(0.05 mg·mL-1)浸沒光纖探針約3 h，保證在光纖表面形成Au-S-S-AuNPs結構，金膜上方形成緊致的AuNPs層，并檢測光譜信號；4.清洗干燥后，滴入40 μL的ABA核酸適配體試劑(1 μm·mol-1濃度)，反應120 min后記錄光譜信息；5.制備0.131、0.653、1.125 μmol·L-1的ABA溶液，分批次與傳感器反應45 min并記錄其光譜信號。

圖8表示了在上述滴定不同試劑的過程中，光纖SPR透射光譜中共振峰位置變化情況，具體共振波長數(shù)值見表4。可以看出在滴定不同試劑會使的SPR特征峰發(fā)生變化，說明了反應環(huán)節(jié)的偶聯(lián)有效，3個低濃度的ABA試劑透射光譜不同，隨著濃度升高共振峰也發(fā)生藍移，由于ABA與適配體發(fā)生特異性結合，其作用力遠大于適配體與納米顆粒的吸附，濃度越高特異性結合的數(shù)量增大，致使原被適配體包裹的金納米顆粒出現(xiàn)不同程度的裸漏，減輕了光纖表面的薄膜厚度，這種特異結合力的作用使共振波長出現(xiàn)變化，同時減少了等離子體共振引起的吸收損耗。當ABA濃度處于10-6量級下，光纖SPR傳感具有一定分辨能力，1 μmol·L-1的濃度變化可使共振波長大約移動1 nm。

圖8 不同試劑的光纖SPR透射光譜及共振峰位置變化情況

表4 ABA檢測試驗中各滴定試劑的共振波長

圖9-a表示了滴定不同濃度梯度(0.1、0.6、1.1、1.6、2.1、2.6 μmol·L-1)ABA試劑的光纖SPR透射光譜，隨著濃度的增大，光纖傳感器的透射光譜向短波長方向移動，在超過2 μmol·L-1時波長變化出現(xiàn)抖動，可能存在適配體脫離金納米顆粒后，適配體與ABA 的結合體進一步影響了光纖傳感層。將濃度與共振波長進行線性擬合，如圖9-b所示，在低濃度范圍內(nèi)，利用該傳感方案檢測ABA具有良好的線性關系，擬合函數(shù)為λ=575.098-1.871C， 線性相關系數(shù)為95.86%，C為ABA的濃度(單位為μmol·L-1)，λ為對應濃度下的共振波長(單位為nm)，1 μmol·L-1濃度變化會產(chǎn)生近1.87 nm波長漂移，即靈敏度為1.87 nm·μmol-1，分辨率為0.535 μmol·nm-1，可以實現(xiàn)光纖SPR傳感檢測ABA濃度。

圖9 不同濃度ABA的透射光譜及濃度擬合曲線

4 結論

本文設計的表面等離子體共振傳感器利用納米顆粒偶聯(lián)包覆在塑料包層光纖纖芯表面的金薄膜上，納米粒子偶聯(lián)金膜后會在兩者之間形成納米量級的局域結構，顆粒極化方向的電場強度可以產(chǎn)生增強，并對外界環(huán)境變化的感知十分靈敏。傳感器在折射率1.333 2～1.337 8范圍的平均波長靈敏度為1 478.26 nm·RIU-1，有利于實現(xiàn)水環(huán)境中生物傳感。將游離態(tài)的金納米粒子自組裝在巰基化的光纖表面，形成表面等離子共振傳感器的納米涂層，10 nm粒徑的金顆粒在0～5 mmol·L-1識別度的共振波長移動了10 nm，整體傳感器對折射率變化的平均傳感靈敏度在2 000 nm·RIU-1。在使用核酸適配體功能化的金納米粒子后，低濃度的植物激素脫落酸分子可以特異性地結合適配體，平均檢測靈敏度為1.87 nm·μmol-1，分辨率為0.535 μmol·nm-1。這種納米顆粒涂敷光纖表面等離子共振傳感的方式具有簡單的制備步驟和較高靈敏度的檢測響應，有望在其他生物小分子的微量低濃度檢測中發(fā)揮作用。