沈惟一 綜述 胡海，蔣兆彥 審校

（同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院膽石病中心，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院膽石病研究所，上海 200120）

膽囊膽固醇結(jié)石?。ê?jiǎn)稱膽石?。┦鞘澜绶秶鷥?nèi)的常見病。成年人的發(fā)病率10%～20%。其中約20%病人會(huì)在一生中出現(xiàn)癥狀[1]。膽結(jié)石形成與以下幾個(gè)方面有關(guān)：遺傳易感性，膽汁中膽固醇和膽汁酸平衡破壞導(dǎo)致膽固醇過飽和，膽囊動(dòng)力功能障礙等[2]。膽囊是儲(chǔ)存膽汁以及結(jié)石形成的場(chǎng)所。膽囊尤其是膽囊黏膜上皮對(duì)于成石的影響值得研究者關(guān)注[3-4]。本文綜述膽囊黏膜上皮功能改變對(duì)膽囊結(jié)石形成的影響。

黏膜上皮吸收功能

一、鈉等金屬離子的吸收

膽囊上皮細(xì)胞頂端有鈉氫交換體 （Na-H exchanger，NHE）、鈉氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na-Cl cotransporter，NCC）等多種離子通道。從膽汁中吸收鈉最重要的途徑是鈉氫交換[5]。在膽固醇結(jié)晶形成前，膽囊NHE活性已增強(qiáng)，上皮細(xì)胞在過飽和膽汁中對(duì)于鈉的吸收增加2倍。這可能與過飽和膽汁降低蛋白激酶 Cα（protein kinase Cα,PKCα）的磷酸化活性，使其對(duì)正常狀況下NHE的抑制調(diào)節(jié)作用減弱有關(guān)[6]。但膽石形成后，膽囊上皮對(duì)鈉的吸收功能逐漸減弱，最終徹底失去主動(dòng)吸收功能。NHE的活性降低，同時(shí)使膽囊酸化膽汁的功能減弱。膽汁內(nèi)以離子形態(tài)存在的鈣不穩(wěn)定，可能進(jìn)一步促進(jìn)膽石增長(zhǎng)。人類膽囊上皮頂端只存在NHE-3亞型。成石后，該亞型的mRNA表達(dá)量增加，雖然蛋白質(zhì)表達(dá)量不變，但其蛋白質(zhì)磷酸化程度升高，使真正具有功能的NHE減少，可能導(dǎo)致成石后膽囊吸收能力下降[5]。

二、水的吸收

膽囊吸收水分僅局限于黏膜皺襞頂部且繼發(fā)于離子轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是鈉離子和氯離子，缺乏任一種都會(huì)妨礙對(duì)水的吸收。上皮細(xì)胞通過細(xì)胞膜的自由擴(kuò)散和膜上的水通道吸收水[7]。膽囊主要表達(dá)水通道蛋白 （aquaporin,AQP）1和AQP8。其中AQP8只表達(dá)于膽囊上皮細(xì)胞頂端。AQP1表達(dá)于細(xì)胞雙側(cè)。雖有報(bào)道在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)到AQP4，但具體定位和功能有待進(jìn)一步證實(shí)，而AQP5被認(rèn)為在膽囊腫瘤中有重要作用[8]。AQP1受激素調(diào)控，血管活性腸肽或胰泌素存在時(shí)，由胞內(nèi)移至頂端胞膜分泌水，而頂端AQP8負(fù)責(zé)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)水。在結(jié)石形成的早期，黏膜上皮對(duì)水的吸收增多，可能繼發(fā)于NHE早期活性增強(qiáng)，鈉吸收增多，進(jìn)一步濃縮膽汁，加速膽固醇結(jié)晶的析出[9]。結(jié)石形成后，膽囊對(duì)于水的吸收功能減弱。雖然小鼠實(shí)驗(yàn)證明膽石存在與AQP減少關(guān)聯(lián)[10]，但在人膽囊，由于研究較少，兩者的關(guān)系尚不確定[11]。

三、膽固醇的吸收

正常膽囊能吸收膽汁中約30%的游離膽固醇[3]。在膽汁酸鹽存在的情況下，膽汁膽固醇與細(xì)胞膽固醇自由交換，因此，膽固醇的凈流入和流出取決于熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定。溫度降低會(huì)減慢膽固醇吸收速度。此外，膽汁中膽汁酸鹽的含量和種類通過影響膽固醇微膠粒與上皮細(xì)胞之間的表面阻力而改變吸收速度。在結(jié)石形成之前，過飽和的膽汁導(dǎo)致膽固醇向上皮細(xì)胞膜凈流入，膽汁膽固醇濃度高時(shí)，雖然吸收比例有所下降，但總體吸收量仍明顯上升。膽汁膽固醇過飽和通常伴隨著黏膜的膽固醇酯含量增多。這可能是由于上皮中催化膽固醇酯合成的膽固醇?；D(zhuǎn)移酶 （acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase，ACAT）以及催化膽固醇向膽汁酸方向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞色素P450家族成員27（cytochrome P450 family 27，CYP27）的活性增加，而水解膽固醇酯的酶（cholesteryl ester hydrolase，CEH）活性并無改變[12]。 但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ACAT及CYP27的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)量并不增加，僅酶活性發(fā)生改變[12]。此外，膽固醇攝取的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NPC1L1在結(jié)石病人肝細(xì)胞中表達(dá)減少，尤其女性[13]。該種蛋白質(zhì)在膽囊上皮細(xì)胞的表達(dá)變化尚不明確，有待進(jìn)一步研究。另外，膽固醇極難溶于水。與腸道吸收膽固醇類似，膽囊黏膜上皮對(duì)膽固醇的吸收依賴于乳化劑的存在。膽汁酸的甾體核疏水，同時(shí)支鏈富含親水基團(tuán)，可與磷脂等其他脂質(zhì)一起形成微膠粒將膽固醇傳遞至上皮細(xì)胞表面。膽汁中磷脂和膽汁酸鹽成分增加，可提高形成微膠粒中的膽固醇量。膽囊黏膜對(duì)微膠粒攜帶的膽固醇更易吸收，導(dǎo)致黏膜脂類沉積。細(xì)胞膜膽固醇成分的改變也可改變膜電位，影響細(xì)胞功能。這些相關(guān)改變均具有促進(jìn)結(jié)石形成的作用。

膽囊分泌功能的改變

生理狀態(tài)下，膽囊上皮濃縮進(jìn)入膽囊的肝膽汁，儲(chǔ)存至下次進(jìn)食后。進(jìn)食后，胰泌素分泌，鈉吸收被抑制，同時(shí)AQP1受調(diào)控由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜頂端向膽囊腔內(nèi)分泌水[9]。不同個(gè)體在這種情況下膽汁成分差異不大。在結(jié)石形成早期，鈉的分泌量并不減少，甚至有所增加，提示這個(gè)階段，黏膜鈉的分泌功能并不因結(jié)石形成而下降。

膽囊上皮還有較強(qiáng)的黏蛋白（mucin，MUC）分泌能力[5]。這些黏蛋白與鈣或磷脂小泡中的膽固醇結(jié)合，促進(jìn)膽固醇結(jié)晶聚集和膽石生長(zhǎng)。但膽汁中黏蛋白濃度與成核時(shí)間之間并無確定關(guān)系。過飽和膽汁中的脂類和疏水性膽汁酸（如去氧膽酸）增多，引發(fā)脂質(zhì)過氧化。這些產(chǎn)物（如丙二醛、花生四烯酸）通過炎癥誘導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor receptor,EGFR）信號(hào)通路，使膽囊上皮細(xì)胞黏蛋白分泌增多[14]。當(dāng)流入膽囊的肝膽汁變稀薄時(shí)，相關(guān)黏蛋白分泌量降低[15]。另外，膽石形成往往伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。這些細(xì)胞在黏膜下層分泌 TNF-α（tumor necrosis factor-α），同樣可上調(diào)EGFR促進(jìn)黏蛋白分泌。增多的黏蛋白以MUC5AC為主，其他黏蛋白（如 MUC1、MUC3、MUC5B）表達(dá)量不變[16]。 有研究表明，黏蛋白與膽囊炎癥相關(guān)，在棕色膽石形成中起重要作用[17]。

膽囊壁可能存在向膽囊腔內(nèi)分泌膽固醇的能力。膽石形成時(shí)，上皮細(xì)胞 ABCG5/8（ATP binding cassette subfamily G member 5/8）的mRNA水平升高，且有實(shí)驗(yàn)證明在接觸過飽和膽汁時(shí)，ABCG5/8會(huì)從黏膜細(xì)胞內(nèi)定位移至頂端。另一種膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1（ATP binding cassette subfamily A member 1）在人類主要表達(dá)于上皮細(xì)胞基底側(cè)，轉(zhuǎn)運(yùn)外周組織內(nèi)的膽固醇和磷脂，防止膽固醇在組織內(nèi)堆積。其在膽固醇相關(guān)膽囊疾病時(shí)表達(dá)同樣升高，分泌至細(xì)胞外的膽固醇會(huì)吸引巨噬細(xì)胞聚集和吞噬膽固醇形成泡沫細(xì)胞[18]。

膽囊黏膜上皮形態(tài)和成分的改變

一、膽囊黏膜上皮細(xì)胞改變

膽囊黏膜根據(jù)不同的結(jié)石類型和成因而發(fā)生改變[19]。在動(dòng)物成石模型中，膽固醇結(jié)石形成最初階段常有上皮細(xì)胞增生和分泌增加。膽囊上皮正常生理狀況下的柵欄樣排列被打亂，細(xì)胞間出現(xiàn)囊泡。這些囊泡可能是上皮細(xì)胞分泌的物質(zhì)，且這種分泌增多的現(xiàn)象早于結(jié)石形成。成石之后，膽囊黏膜增厚，固有層水腫，上皮出現(xiàn)凹陷，表面AQP1/8表達(dá)下降，細(xì)胞DNA合成活躍[10]。這些改變并不只是膽固醇過飽和膽汁及膽石物理刺激的結(jié)果。上皮細(xì)胞所處的微環(huán)境以及與炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等可能相互作用，共同構(gòu)成膽囊壁的變化。在體外培養(yǎng)的人膽囊細(xì)胞中，同樣出現(xiàn)細(xì)胞分裂活動(dòng)旺盛的現(xiàn)象。這些細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)上的變化，根據(jù)上皮接觸到的特定膽汁酸和脂類成分的不同而呈現(xiàn)差異。

二、膽囊上皮基質(zhì)和炎性因子

膽囊壁炎癥也是膽石形成過程中的早期現(xiàn)象，出現(xiàn)于膽固醇結(jié)晶形成后、膽石形成之前。T細(xì)胞在成石過程中起一定作用。膽汁中膽固醇刺激T細(xì)胞，尤其是Th1細(xì)胞，分泌IL-1、IFN-γ、TNF-α[20]。 巨噬細(xì)胞也被認(rèn)為參與膽囊炎性反應(yīng)。TNF-α和IL-1α與CD68（巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志）表達(dá)呈正相關(guān)。在膽石病中TNF-α通過刺激其他炎性因子起膽囊壁炎癥始動(dòng)作用。受IL-1和TNF-α的誘導(dǎo)，IL-6的表達(dá)升高，維持炎性環(huán)境，促使急性炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)槁?。外環(huán)境的炎性因子增加一氧化氮的產(chǎn)生，損傷正常上皮DNA。同時(shí)，炎性細(xì)胞蛋白酶分解，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TFPI（tissue factor pathway inhibitor），局部血流減少。膽囊上皮細(xì)胞的生存微環(huán)境惡劣。壞死或凋亡的上皮細(xì)胞向膽囊腔內(nèi)剝落，可能成為潛在的成核因素[21]。

骨橋蛋白（osteopontin,Opn）也被認(rèn)為參與膽石形成。其是酸性非膠原骨基質(zhì)蛋白質(zhì)。充盈型膽石的膽囊壁常能檢測(cè)到高于正常的Opn表達(dá)。甚至出現(xiàn)炎癥前，Opn的mRNA和蛋白質(zhì)水平已升高。膽囊平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及由正常上皮退化而來的立方體上皮細(xì)胞表達(dá)Opn的免疫活性。在骨組織中Opn的氨基酸序列有較強(qiáng)的鈣結(jié)合能力，被認(rèn)為有助于骨礦化。且有實(shí)驗(yàn)表明Opn呈網(wǎng)狀分布在膽色素結(jié)石中[22]。因此，Opn一度被認(rèn)為是膽石成石的促進(jìn)因素。近年研究認(rèn)為，單純從膽囊的角度看，Opn通過抗成核作用，對(duì)膽固醇膽石有預(yù)防作用[23]。但Opn通過影響肝臟膽汁酸代謝酶，如CYP7A1[24]或通過腸道膽固醇吸收相關(guān)蛋白質(zhì)（Niemann-Pick C1 like 1 蛋白）[25]促進(jìn)膽石形成。

三、膽囊上皮間質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞

膽石存在時(shí)膽囊壁往往有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多，包括肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞、樹突細(xì)胞等[26]。喂養(yǎng)高膽固醇飼料的小鼠在成石后，膽囊固有層水腫，成纖維細(xì)胞增多。巨噬細(xì)胞在炎性浸潤(rùn)中作用顯著。形成泡沫細(xì)胞和炎性息肉時(shí)，都有巨噬細(xì)胞的參與。但慢性炎癥時(shí)，巨噬細(xì)胞數(shù)量反而減少。

終隔細(xì)胞又稱特絡(luò)細(xì)胞。間質(zhì)細(xì)胞中終隔細(xì)胞主要定位于固有層，與肌層相連[27]。有報(bào)道稱該種細(xì)胞在膽石病時(shí)數(shù)量減少。膽固醇過飽和膽汁可直接產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[28]。其中高濃度膽酸和脂類增加局部TNF-α含量，通過Caspase 8/3誘導(dǎo)凋亡，減少終隔細(xì)胞數(shù)量。部分膽汁酸成分，如甘氨膽酸和牛磺膽酸，對(duì)終隔細(xì)胞在膽固醇過飽和膽汁中有保護(hù)作用[29]。另外，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)也會(huì)通過損傷細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減少終隔細(xì)胞[30]。除數(shù)量上的變化，終隔細(xì)胞在膽石形成后位置重新分布，從肌層面重分布至固有層近黏膜面[31]。雖然膽石形成時(shí)終隔細(xì)胞變化明顯，但其是否成為影響膽囊收縮的決定性因素仍有待進(jìn)一步研究[31]。

中性粒細(xì)胞在結(jié)石形成中起至關(guān)重要的作用。其不僅作為浸潤(rùn)上皮的炎性細(xì)胞出現(xiàn)，更重要的是其NET（neutrophil extracellular trap）作用。NET是由中性粒細(xì)胞崩解，釋放出胞外的染色體外 DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA），并組成顆粒蛋白。因此，NET具有包裹病菌或異物的功能[32]。在膽汁中有晶體，局部有活性氧產(chǎn)物存在時(shí)，NET就會(huì)形成。其起類似網(wǎng)兜的作用，吸附膽固醇和鈣沉積于結(jié)石上。因此，無論膽囊是否有炎癥，結(jié)石為色素或膽固醇性，都可從結(jié)石上檢測(cè)到ecDNA。在生理狀況下，女性形成NET的水平明顯高于男性[33]。這可能是除雌激素外另一個(gè)促進(jìn)女性高膽石發(fā)病率的因素。

結(jié) 語(yǔ)

膽囊作為消化系統(tǒng)的一部分，主要承擔(dān)膽汁儲(chǔ)存、濃縮等功能。其功能和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)容易打破，甚至形成惡性循環(huán)。成石早期過飽和膽汁刺激鈉吸收增多，伴隨水吸收增多，膽汁進(jìn)一步濃縮，析出結(jié)晶。這類膽汁刺激黏蛋白分泌，加速上皮細(xì)胞增生脫落，促進(jìn)成核；改變膜電位，使終隔細(xì)胞凋亡，削弱膽囊收縮；誘導(dǎo)上皮中一系列炎性反應(yīng)，產(chǎn)生過氧化產(chǎn)物，形成NET加速結(jié)石沉積。結(jié)石形成后，長(zhǎng)期摩擦膽囊上皮激化炎癥，直接妨礙收縮。成石過程中的一系列產(chǎn)物，如炎性因子，活性氧，損害吸收和分泌功能。因此，加強(qiáng)對(duì)膽囊黏膜上皮功能及其在成石中作用的認(rèn)識(shí)，對(duì)于膽石病防治具有重要意義。