向茂源，張獻(xiàn)全

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，重慶）

1 CAR-T細(xì)胞療法的發(fā)展歷程

數(shù)十年來(lái)，腫瘤學(xué)家一直致力于潛心專(zhuān)研人體免疫系統(tǒng)的潛在特性。隨著對(duì)白細(xì)胞特性認(rèn)識(shí)的不斷加深，免疫療法之母即同種異體干細(xì)胞移植(alloSCT)得到了發(fā)展。Kolb[1]于他1998年發(fā)表的論文中提出了證據(jù)，證明供體淋巴細(xì)胞輸血可以使復(fù)發(fā)的慢性髓系白血病患者獲得持久緩解。

雙特異性T細(xì)胞抗體CD19×CD3（the bispecific T- cellrecruiting antibody construct CD19×CD3）也能夠清除白血病及淋巴瘤[2]。這些雙特異性抗體（BiTE）由兩個(gè)單鏈可變片段組成，一個(gè)以腫瘤相關(guān)抗原為靶點(diǎn)，另一個(gè)以T細(xì)胞相關(guān)抗原為靶點(diǎn)，旨在引導(dǎo)T細(xì)胞活化，從而攻擊腫瘤細(xì)胞。

2 CAR-T的結(jié)構(gòu)及制造方法

不同于傳統(tǒng)T細(xì)胞受體（TCR），CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤的清除不需要與人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)結(jié)合，而是依賴(lài)于嵌合抗原受體（CAR）分子，這可以減少腫瘤細(xì)胞中由 HLA表達(dá)引起的免疫性逸。同時(shí)，CAR-T細(xì)胞具有分化成記憶T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，由此可建立長(zhǎng)期的抗腫瘤活性。

2.1 CAR-T的結(jié)構(gòu)組成

CAR是基因改造的T細(xì)胞受體，其結(jié)合了腫瘤相關(guān)抗原結(jié)構(gòu)域[常由抗體產(chǎn)生的單鏈可變片段（scFv）]、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和受體的共刺激結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白IgG1、IgG4、IgD和CD8分子形成鉸鏈區(qū)，其與scFv的靈活性相關(guān)。T細(xì)胞的CD3ζ、CD4、CD8、CD28分子形成跨膜區(qū)序列。共刺激結(jié)構(gòu)域主要通過(guò)CD3ζ、CD28、CD27、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)等分子激活T細(xì)胞。

CAR-T細(xì)胞至今已發(fā)展四代。1987年，第一代CARs由Kuwana提出并設(shè)計(jì)[5]，彼時(shí)的CARs僅具有CD3ζ結(jié)構(gòu)域，它們不能產(chǎn)生足夠的白介素-2（IL-2），從而無(wú)法啟動(dòng)持續(xù)、有效的T細(xì)胞反應(yīng)。隨后，第二代CARs出現(xiàn)，二代CARs受益于雙信號(hào)T細(xì)胞抗體，如CD28或4-1BB。當(dāng)CAR識(shí)別腫瘤靶點(diǎn)時(shí)，共刺激分子可有效地增強(qiáng)IL-2的合成，增強(qiáng)抗腫瘤活性。第三代CARs增加了更多的共刺激分子，如：OX40（CD134）、CD28、CD27、DAP10等。由于胞內(nèi)區(qū)有2個(gè)共刺激信號(hào)分子，第三代CARs在體內(nèi)的增殖能力和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力又得到了進(jìn)一步提高。第四代CARs通過(guò)細(xì)胞因子分泌的額外轉(zhuǎn)基因(如IL-12)或額外的共刺激配體的修飾，使免疫反應(yīng)更加激烈，從而使抗腫瘤活性得到增強(qiáng)。

2.2 CAR-T的制造方法

CAR-T細(xì)胞的制造是非常復(fù)雜、精心控制的程序。該程序包括三大步驟：T淋巴細(xì)胞的體外富集、CAR-T細(xì)胞的制備、大規(guī)模擴(kuò)展。CAR-T細(xì)胞過(guò)繼治療是一種以自體細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療，通過(guò)白細(xì)胞分離術(shù)收集患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，再分離出特定的T細(xì)胞亞群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+ T細(xì)胞[6]。

分離出的T細(xì)胞起始亞群需要持續(xù)和充分的激活才能實(shí)現(xiàn)體外擴(kuò)增。這就需要通過(guò)T細(xì)胞受體（信號(hào)1）和CD28、4-1BB或OX40（信號(hào)2）等共刺激信號(hào)產(chǎn)生主要的特異性信號(hào)，從而激活T細(xì)胞。再通過(guò)電穿孔、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將CAR基因?qū)爰せ畹腡細(xì)胞中進(jìn)行基因修飾，從而得到可表達(dá)CAR基因的CAR-T細(xì)胞。其中，慢病毒載體比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體提供了更安全的基因組整合概況，因此已被廣泛用于CAR-T細(xì)胞療法的臨床試驗(yàn)中[7]。

對(duì)獲得的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行免疫分型、存活力、內(nèi)毒素等方面的檢測(cè)，在確保生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞純度和安全性達(dá)到要求后回輸給患者，實(shí)現(xiàn)CAR-T免疫治療。

3 目標(biāo)抗原的選擇

嵌合抗原受體（CAR）通過(guò)識(shí)別抗原，激活T細(xì)胞，從而殺死腫瘤。由于相當(dāng)一部分目標(biāo)抗原在非腫瘤細(xì)胞上也有表達(dá)，由此在對(duì)抗腫瘤同時(shí)也對(duì)非腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生損害，也就是脫靶效應(yīng)。因此，理想的目標(biāo)應(yīng)該具有高覆蓋度和高特異性，以確保有效性和安全性。

3.1 血液腫瘤目標(biāo)抗原

目前，大多數(shù)具有良好臨床效果的CAR-T療法都符合高覆蓋率的選擇標(biāo)準(zhǔn)，例如CD19，CD20，CD22，CD23和B細(xì)胞成熟抗原（BCMA）等[8]。

用戶(hù)力是指促進(jìn)消費(fèi)升級(jí)不僅僅在于技術(shù)和生活層面，也不僅僅是財(cái)富和資產(chǎn)的多寡，更多的是幸福感、意義感、價(jià)值感等能否形成真正的統(tǒng)一。場(chǎng)景時(shí)代用戶(hù)有四大特征：首先，對(duì)高尚事物的追求與感動(dòng)；其次，對(duì)社群文化充滿(mǎn)專(zhuān)注和自信；再次，較高的人文素養(yǎng)與審美能力；此外，明確的社交態(tài)度與道德水準(zhǔn)。

以CD19為例，由于CD19在B細(xì)胞白血病和淋巴瘤中的高覆蓋率，它被選為CAR-T療法中使用最廣泛的靶標(biāo)。靶向CD19的CAR-T細(xì)胞對(duì)兒童和成人難治復(fù)發(fā)性B-ALL、慢性淋巴細(xì)胞白血病、非霍奇金淋巴瘤都呈現(xiàn)出持續(xù)高效的抗腫瘤活性，總緩解率在不同研究中維持在70%-94%[9]。

但是，就特異性而言，CD19不是理想的靶標(biāo)。CD19表達(dá)于B細(xì)胞，在靶向CD19的CAR-T療法的抗腫瘤作用下，正常的B細(xì)胞也將被清除。因此，CAR-T細(xì)胞療法常見(jiàn)的靶標(biāo)事件便是B細(xì)胞發(fā)育不全。幸運(yùn)的是，近年來(lái)隨著臨床管理的提升，大部分患者可耐受B細(xì)胞發(fā)育不全。

CD22在成熟的淋巴瘤以及急性B淋巴細(xì)胞白血病上高表達(dá)，臨床結(jié)果表明，靶向CD22 CAR-T治療已帶來(lái)可觀的療效[10]。CD23在慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）上表達(dá)，但在正常B細(xì)胞 上不表達(dá)，臨床研究表明抗CD23 CAR-T細(xì)胞對(duì)CLL細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定影響[11]。

CD20和BCMA也是如此。盡管它們并未在腫瘤細(xì)胞上嚴(yán)格表達(dá)，但由于其高覆蓋率和可耐受的脫靶效應(yīng)，這些靶標(biāo)已顯示出廣闊的臨床前景。

3.2 實(shí)體瘤目標(biāo)抗原

與血液惡性腫瘤相比，實(shí)體瘤具有更加復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境（TME），多種免疫抑制機(jī)制和多種生化因素構(gòu)建的物理障礙使得CAR-T細(xì)胞難以找準(zhǔn)準(zhǔn)確的靶點(diǎn)攻擊腫瘤細(xì)胞，因此針對(duì)實(shí)體瘤的目標(biāo)抗原的研發(fā)更加困難。

由于腫瘤特異性抗原（TSA）在實(shí)體瘤細(xì)胞中有著獨(dú)特而豐富的表達(dá)[12]，它被選為最合適的目標(biāo)抗原。但是，這些抗原在患有相同類(lèi)型腫瘤的患者中異質(zhì)性很高，必須為每位患者確定合適的TSA，再生成特異性CAR-T細(xì)胞[13]。這是一個(gè)非常復(fù)雜且昂貴的過(guò)程，因此，盡管TSA可以作為CAR-T細(xì)胞的理想靶標(biāo)，但臨床運(yùn)用很少[14]。隨著基因工程領(lǐng)域的發(fā)展，另一種類(lèi)型的腫瘤抗原——腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。盡管抗原TAA過(guò)表達(dá)于腫瘤組織，但其在正常組織中仍有較低的表達(dá)水平，因此經(jīng)常會(huì)引起腫瘤外毒性[15]。盡管TSA和TAA是實(shí)體CAR-T療法的首選，但當(dāng)這些療法不能滿(mǎn)足應(yīng)用需求時(shí)，尋找其他類(lèi)型的靶標(biāo)就變得至關(guān)重要。

一類(lèi)替代抗原如成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR-2），已經(jīng)取得很好的研究。這類(lèi)靶標(biāo)在腫瘤細(xì)胞本身不表達(dá)，但在與FAP[16]或VEGFR-2[17]相關(guān)的腫瘤脈管系統(tǒng)中高表達(dá)，CAR-T細(xì)胞可通過(guò)識(shí)別這類(lèi)抗原阻礙基質(zhì)形成或血管生成來(lái)破壞腫瘤生長(zhǎng)。除上述靶標(biāo)外，雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂2（GD2）靶點(diǎn)治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤、HER2靶點(diǎn)治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[18]、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）靶點(diǎn)治療肝癌以及癌胚抗原（CEA）靶點(diǎn)治療腸癌的CAR-T細(xì)胞療法也已有相關(guān)研究。

開(kāi)發(fā)針對(duì)實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞療法的最大挑戰(zhàn)是尋找有效表達(dá)于腫瘤組織而不表達(dá)于健康組織的靶抗原。

4 CAR-T所面臨的挑戰(zhàn)

盡管CAR-T這項(xiàng)新技術(shù)取得了令人矚目的成果，但由于其嚴(yán)重且常見(jiàn)的不良反應(yīng)以及與之相關(guān)的高昂費(fèi)用，CAR-T細(xì)胞療法所面臨的挑戰(zhàn)已成為學(xué)術(shù)界討論的熱門(mén)話(huà)題。CAR-T細(xì)胞療法相關(guān)的毒性與傳統(tǒng)化療及其他靶向療法不同，CAR-T細(xì)胞治療最常見(jiàn)的毒性反應(yīng)是細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)和免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)的神經(jīng)毒性綜合癥（ICANS），其他不良反應(yīng)包括脫靶效應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)、腫瘤復(fù)發(fā)等[19]。

4.1 細(xì)胞因子釋放綜合征

細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS），也稱(chēng)為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，是由于細(xì)胞療法清除腫瘤時(shí)，激活了大量淋巴細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞因子（如IL-6、IL-8、IL- 10、TNF-α和IFN-γ等）升高而引起的一系列炎癥癥狀，主要表現(xiàn)為持續(xù)高燒、惡心、肌痛、關(guān)節(jié)痛，并可演變成毛細(xì)血管滲漏、缺氧和低血壓，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致器官衰竭。

IL-6是一種具有抗炎和促炎特性的多效性細(xì)胞因子，已被認(rèn)為是CRS毒性的主要介質(zhì)[20]。DAVILA 等[21]利用CAR-T治療16例復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞CLL，緩解率均為80%以上，在治療過(guò)程他們發(fā)現(xiàn)其中出現(xiàn)嚴(yán)重CRS反應(yīng)的患者多數(shù)具有較高的IL-6水平。因此，阻斷或結(jié)合IL-6受體成為治療CRS的重要環(huán)節(jié)。目前，托珠單抗（Tocilizumab）和司托昔單抗（Siltuximab）已成為治療中重度CRS的首選藥物。2017年8月，托珠單抗已被FDA批準(zhǔn)用于CAR-T細(xì)胞治療后發(fā)生的CRS[22-23]。

4.2 免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)的神經(jīng)毒性綜合癥

神經(jīng)毒性是CAR-T細(xì)胞療法第二常見(jiàn)的嚴(yán)重不良反應(yīng)，常發(fā)生在CAR-T細(xì)胞輸注后的第3或第4周[24]，可發(fā)展為中毒性腦病，伴有精神錯(cuò)亂、失語(yǔ)、共濟(jì)失調(diào)、譫妄、癲癇發(fā)作和腦水腫[25]。這些神經(jīng)系統(tǒng)副作用的發(fā)生機(jī)制仍未完全了解，可能與CAR-T細(xì)胞進(jìn)入腦脊液中相關(guān)，由此，研究者將CAR-T治療擴(kuò)展到用于治療中樞系統(tǒng)白血病及其他腫瘤性疾病，目前相關(guān)研究需要進(jìn)一步深入。

4.3 脫靶效應(yīng)

CAR-T細(xì)胞在攻擊腫瘤時(shí)，由于其對(duì)應(yīng)的腫瘤靶抗原也表達(dá)于正常組織中，故攻擊腫瘤時(shí)會(huì)同時(shí)攻擊表達(dá)目標(biāo)抗原的正常細(xì)胞，造成臟器損傷，即脫靶效應(yīng)。Morgan等[26]設(shè)計(jì)包含CD28、4-1BB和CD3ζ信號(hào)的CAR-T治療一名結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移患者，注射1010個(gè)細(xì)胞，15 min后患者表現(xiàn)為呼吸困難且胸部X光顯示出現(xiàn)肺部浸潤(rùn)現(xiàn)象，并于5天后死亡。死亡原因被認(rèn)為是患者肺部上皮細(xì)胞低水平表達(dá)的ERBB2被CAR-T細(xì)胞識(shí)別，使得大量CAR-T細(xì)胞定位于肺部并攻擊肺部細(xì)胞所致。因此現(xiàn)階段尋找腫瘤特異性抗原是CAR-T治療癌癥的關(guān)鍵一步，以實(shí)現(xiàn)不同癌癥的特異性治療。

4.4 高耐藥率

經(jīng)過(guò)多項(xiàng)研究表明，經(jīng)CAR-T細(xì)胞治療難治性CD19陽(yáng)性B細(xì)胞惡性腫瘤的患者表現(xiàn)出優(yōu)異的長(zhǎng)期緩解，甚至可治愈。但是，在細(xì)胞療法后達(dá)到完全緩解的患者中，1年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)30-50%，此外，約10-20%的患者在治療后未達(dá)到完全緩解[27-28]。

CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)測(cè)在細(xì)胞治療后的持久緩解中起著重要作用[29]。CAR-T細(xì)胞持續(xù)性的喪失可能是抗原陽(yáng)性復(fù)發(fā)的重要決定因素。最近，在CD19表達(dá)陰性的B-ALL中，接受CAR-T細(xì)胞治療的小兒和成年應(yīng)答者均報(bào)告有腫瘤細(xì)胞[27-30]?；趯?duì)細(xì)胞療法耐藥性機(jī)制的了解，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出新穎的潛在治療策略，包括雙重靶向療法以及多方位CAR-T細(xì)胞療法。

除了以上幾個(gè)常見(jiàn)毒副反應(yīng)，CAR-T治療需要大量預(yù)處理，但仍然不能獲得持久的反應(yīng)。CAR-T細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，將CAR-T細(xì)胞與凋亡抑制劑阻斷劑聯(lián)合使用，有可能提高其治療效果[31]。

鑒于CAR-T細(xì)胞療法存在致命的不良反應(yīng)，且不能達(dá)到持久的抗腫瘤反應(yīng)，因此，直到現(xiàn)在，CAR-T細(xì)胞療法僅對(duì)極少數(shù)晚期血液惡性腫瘤患者有效，對(duì)其他血液腫瘤、實(shí)體瘤的臨床應(yīng)用仍面臨著極大的挑戰(zhàn)。

5 展望

經(jīng)過(guò)近三十年的發(fā)展，CAR-T才得以應(yīng)用于少數(shù)晚期血液腫瘤，主要限于小劑量臨床試驗(yàn)。對(duì)于難治性B細(xì)胞惡性腫瘤，其顯著的反應(yīng)令人信服。但是，仍然有很多問(wèn)題亟待解決。什么時(shí)候是使用CAR-T細(xì)胞的最佳時(shí)機(jī)？哪些患者從中受益最大？CAR-T細(xì)胞療法可以替代干細(xì)胞移植嗎？以上問(wèn)題，需要進(jìn)一步通過(guò)研究可反映療效的生物學(xué)標(biāo)記來(lái)解答。

除了以上問(wèn)題外，還需解決耐藥性，疾病復(fù)發(fā)，嚴(yán)重的副作用和持久性等各種問(wèn)題。CAR-T細(xì)胞毒性的管理也處于早期階段。隨著越來(lái)越多的可用數(shù)據(jù)，毒性管理在未來(lái)幾年肯定會(huì)發(fā)生重大變化。研究重點(diǎn)包括更好地了解細(xì)胞因子和其他炎癥蛋白在介導(dǎo)毒性中的作用[32]，可以實(shí)時(shí)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子檢測(cè)某些患者的毒性嚴(yán)重程度并直接干預(yù)其免疫抑制。

迄今為止，盡管CAR-T療法在治療某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤中獲得顯著進(jìn)展，但在實(shí)體瘤中，尚需克服很多障礙。當(dāng)然，對(duì)于CAR-T細(xì)胞，這些仍處于初期，但是如果在以后的臨床試驗(yàn)中獲得陽(yáng)性結(jié)果，這種革命性的免疫療法將適用于多種腫瘤。

總之：CAR-T細(xì)胞療法打響了新興的腫瘤免疫之戰(zhàn)。