武晗琪，倪利曉，2，杜存浩

（1.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098；2.河海大學(xué)淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098）

0 引言

基質(zhì)、水生植物、微生物作為人工濕地的三要素，能通過(guò)物理攔截、化學(xué)吸附、生物降解去除水體中的污染物[1-2]。而阻礙濕地大規(guī)模運(yùn)行的主要問(wèn)題就是濕地堵塞，一旦發(fā)生堵塞，水流不通淤積，滋生蚊蠅，加速水質(zhì)惡化。近年來(lái)，眾多研究學(xué)者從水力條件、基質(zhì)成分、微生物構(gòu)成等多個(gè)方面分析堵塞產(chǎn)生原因[3－6]。引起濕地堵塞的主要有以下幾類原因：懸浮物的累積，植物根系不斷增長(zhǎng)，反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀物、生物膜[7－10]。其中生物膜又是造成堵塞的主要原因[10]。生物膜主要構(gòu)成是微生物和及其分泌的胞外聚合物(EPS)[11]。EPS的吸附能力強(qiáng)，絮凝性好，不僅可以作為保護(hù)層防治細(xì)胞被有毒物質(zhì)殺死，又能作為營(yíng)養(yǎng)源向細(xì)胞提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]。但過(guò)量的EPS 會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)孔隙率降低，形成生物堵塞[13－15]。EPS的主要成分又為蛋白質(zhì)和多糖[16]。BASUVARAJ M 等[17]認(rèn)為EPS的成分比EPS的含量對(duì)堵塞的影響更大。大分子的多糖和其凝膠化行為會(huì)使孔隙內(nèi)多糖含量增加，且累積不易去除，與生物堵塞更顯著相關(guān)[18－19]。因此，研究潛流人工濕地的胞外多糖的累積對(duì)探究人工濕地堵塞形成具有重要意義。

曝氣能夠改善濕地的水力效率和微生物降解的作用[20]。通過(guò)曝氣溶氧，一方面可以通過(guò)切割作用提高氧氣有效轉(zhuǎn)移率：另一方面溶解氧的提高有利于植物根系吸收氧氣，加強(qiáng)植物吸收作用及微生物好氧反應(yīng)[21]。因此，本文以垂直潛流人工濕地作為研究對(duì)象，探討不同程度的曝氣對(duì)人工濕地胞外多糖的累積和特性粘度影響，同時(shí)提取純化胞外多糖探究其成分構(gòu)成，以期為深入了解人工濕地堵塞形成奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

潛流人工濕地示意見(jiàn)圖1。

圖1 潛流人工濕地示意

本實(shí)驗(yàn)裝置由4 組均質(zhì)亞克力塑料桶 (桶高100 cm，內(nèi)徑45 cm)組成。桶底分別填上厚度5 cm，d50為5 mm 的礫石和厚度60 cm，d50為2 mm 的粗砂(d10=0.5 mm,不均勻系數(shù)Cμ=4.2,初始孔隙率n=0.31)。取水管位置分別位于桶高20，40 和60 cm處。污水由裝置上方的進(jìn)水口引入，出水口位于底端。盤式曝氣器直徑為10 cm，表面孔隙率約為0.5，置于距地面40 cm 處，以期獲得較優(yōu)的污染物去除效果。

1.2 運(yùn)行方式

2018年12月10日啟動(dòng)裝置。利用流量計(jì)控制進(jìn)水流量為0.1 m3/d，進(jìn)水負(fù)荷控制在0.5 m3/(m2·d)。氣水比為6∶1 時(shí)有利于處理高負(fù)荷污水[22]。故本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置氣水比為0∶1，3∶1，6∶1，9∶1 這4 組反應(yīng)器。利用脈沖曝氣方式，每日定時(shí)曝氣(19∶00～次日7∶00，每小時(shí)曝氣停歇比為1∶2)，至2019年7月10日停止運(yùn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)水質(zhì)及基質(zhì)取樣

為排除進(jìn)水中的多糖和多聚糖雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，本實(shí)驗(yàn)采用模擬實(shí)驗(yàn)用水。主要污染物濃度見(jiàn)表1。其中用乙醇、氯化銨和磷酸二氫鉀分別作為模擬用水的外加碳源、氮源和磷源。

表1 實(shí)驗(yàn)進(jìn)水水質(zhì)主要污染物平均質(zhì)量濃度 mg·L－1

利用柱狀土壤采樣器采集基質(zhì)層內(nèi)部10，30 及50 cm 處樣品。將所采取樣品的平均值表征該平面的胞外多糖相關(guān)檢測(cè)值。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的指標(biāo)中胞外多糖濃度采用熱提取法測(cè)定[23]；蛋白質(zhì)含量采用Bradford 法測(cè)定[23]；DNA含量采用二苯胺比色法測(cè)定：特性粘度采用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)(NDJ－1)測(cè)定。

1.5 胞外多糖純度分析及紅外光譜分析

純度分析：將所得多糖的利用紫外分光光度計(jì)(SP－752)于190～400 nm 區(qū)間內(nèi)掃描分析確定。

傅里葉紅外光譜(FT－IR)分析：采用FT－IR 光譜儀(Nicolet Nexus 470型)，官能團(tuán)分析利用KBr 壓片法[24]。

1.6 微觀結(jié)構(gòu)分析

將精制多糖噴鍍金膜，采用掃描電鏡 (FEIQuanta－200)觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 胞外多糖累積濃度的時(shí)間變化

各組的胞外多糖濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化見(jiàn)圖2。裝置運(yùn)行后，實(shí)驗(yàn)組的胞外多糖含量在各個(gè)采樣時(shí)間內(nèi)小于空白組。且隨著氣水比的增大，胞外多糖濃度降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，氣水比3∶1，6∶1 和9∶1 組的胞外多糖累積含量分別下降了36%，57%和74%。氣水比0∶1 組，在濕地開始運(yùn)行60 d 內(nèi)(12月10日至2月10日)，胞外多糖濃度保持中高速增長(zhǎng)。在60 d 至120 d 時(shí)(2月10日至4月10日)，出現(xiàn)高速增長(zhǎng)，而后速度降緩。這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)開始于冬季，不利于微生物的生長(zhǎng)，而2～4月的溫度已上升至微生物適宜生長(zhǎng)溫度，能加快微生物繁殖，引起胞外多糖含量激增。隨著時(shí)間推進(jìn)，溫度繼續(xù)上升，微生物生長(zhǎng)再次受到限制，胞外多糖濃度降低。氣水比分別為3∶1，6∶1 和9∶1 組在整個(gè)運(yùn)行時(shí)間內(nèi)各增速都比較穩(wěn)定。對(duì)圖2 中各組數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，得到相關(guān)增量方程見(jiàn)表2。氣水比0∶1 組的k值最高，達(dá)3.663。實(shí)驗(yàn)組的k值都明顯低于未曝氣組。隨著曝氣程度增加，k值減小，這意味著曝氣能夠減緩胞外多糖的累積速率，降低基質(zhì)中胞外多糖的含量。

圖2 各組胞外多糖隨時(shí)間的變化

表2 各組胞外多糖特性積累方程

2.2 基質(zhì)胞外多糖累積濃度的空間變化

實(shí)驗(yàn)前后各組在不同深度的胞外多糖含量見(jiàn)圖3。隨著工況的運(yùn)行，各組的胞外多糖濃度在不同深度上都有不同程度的提升。在水深10 cm 和30 cm 處，實(shí)驗(yàn)組的胞外多糖累積含量顯著低于空白組，推測(cè)可能溶氧的升高提高微生物的活性，加快微生物代謝速率，降低有機(jī)物的累積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，氣水比0∶1 組在水深10 cm 和30 cm 的胞外多糖含量最高，占據(jù)了系統(tǒng)總量的75%以上，考慮水流方向是自上向下流動(dòng)，推測(cè)氣水比0∶1 組的微生物主要積累于中上層部分。同時(shí)系統(tǒng)中的溶解氧主要依靠進(jìn)水中的溶解氧和大氣溶氧，造成溶解氧沿程損耗，底部的溶解氧含量較低，不利于微生物生長(zhǎng)，降低胞外多糖分泌。氣水比3∶1 和6∶1 組在深度方向上都出現(xiàn)先降低后增大的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)在水深30 cm 處，氣水比6∶1 組多糖累積僅為2.62 mg/g 基質(zhì)，是空白組在同一位置同一時(shí)間的0.20倍，是自身同一位置初始值的6.39倍。實(shí)驗(yàn)組在水深50 cm 處的胞外多糖含量明顯升高，可能是一方面是由于殘余溶解氧進(jìn)入基質(zhì)底層，從而破壞了原有的厭氧還原態(tài)環(huán)境，抑制細(xì)菌的活性，有機(jī)質(zhì)不能充分降解而使胞外多糖大量積累所產(chǎn)生。另一方面則是因?yàn)樯蠈悠貧鈴?qiáng)度所產(chǎn)生的高速氣流與進(jìn)水混合所產(chǎn)生的湍流對(duì)基質(zhì)顆粒的摩擦剪切作用剝離大量的胞外多糖與進(jìn)水顆粒物質(zhì)混合體，隨進(jìn)水在底層重新沉降所額外產(chǎn)生的積累量。白少元等[25]在相似的研究中也發(fā)現(xiàn)底層堵塞物含量略高于表層。

圖3 各組胞外多糖隨深度變化

2.3 曝氣對(duì)胞外多糖特性粘度的影響

利用精制胞外多糖分別配置成質(zhì)量濃度為25，50，100，200 和400 mg/L 的梯度溶液測(cè)定動(dòng)力粘度獲得的特性回歸曲線見(jiàn)圖4。胞外多糖濃度與其對(duì)應(yīng)的特性粘度之間的反饋?zhàn)饔米駨亩?jí)指數(shù)關(guān)系，說(shuō)明隨著基質(zhì)表面胞外多糖積累量的增長(zhǎng)，其對(duì)過(guò)水的阻滯作用也將越來(lái)越顯著。當(dāng)胞外多糖積累量達(dá)到一定濃度時(shí)，粘度的影響將超出濃度增長(zhǎng)的影響。

圖4 胞外多糖特性粘度曲線

各組胞外多糖濃度及純水對(duì)應(yīng)的特性粘度見(jiàn)圖5。其中，氣水比0∶1 的特性粘度最高(2.10 ± 0.11 mPa·s)，與純水相比其特性粘度增加了近2.4倍。而曝氣組的特性粘度分別下降了13.4%（氣水比3∶1），30.1%（氣水比6∶1）及41.7%（氣水比9∶1），這意味著曝氣能降低胞外多糖的特性粘度，提升過(guò)水能力。最低濃度的胞外多糖(氣水比9∶1)，其粘度都高于純水的特性粘度，這可能暗示濕地運(yùn)行出現(xiàn)生物膜且分泌胞外多糖時(shí)，基質(zhì)孔隙之間的過(guò)水阻力要遠(yuǎn)高于初始狀態(tài)，并且將大大延長(zhǎng)水力停留時(shí)間。

圖5 各組胞外多糖的特性粘度

2.4 胞外多糖提取、純化與分析

胞外多糖提取及純化的主要成分質(zhì)量濃度見(jiàn)表3。

表3 胞外多糖溶液的提取及純化的主要成分質(zhì)量濃度 mg·L－1

胞外多糖含量隨著氣水比的增加而降低，曝氣組平均降幅達(dá)到38.8%，驗(yàn)證了曝氣對(duì)胞外多糖的累積有反作用。經(jīng)Sevga 法脫蛋白后，各組蛋白含量平均脫除率達(dá)83.6%，胞外多糖平均產(chǎn)率為88.9%。經(jīng)過(guò)DEAE 纖維素層析純化后，蛋白質(zhì)和DNA 的最終平均脫除率達(dá)到98.6%與81.0%，胞外多糖所占比例達(dá)97.5%。

層析提純液在260～280 nm 處的吸收峰見(jiàn)圖6，并不明顯，表明蛋白質(zhì)及核酸雜質(zhì)已經(jīng)被基本去除，不會(huì)妨礙后續(xù)的理化測(cè)試。

圖6 胞外多糖樣品紫外掃描特性曲線

2.5 胞外多糖傅里葉紅外光譜分析

胞外多糖樣品的傅里葉紅外光譜掃描圖譜見(jiàn)圖7。3 433 cm-1處強(qiáng)寬峰的出現(xiàn)代表O-H 基團(tuán)伸縮振動(dòng)作用，2 923 cm-1處的吸收峰為糖類C-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)，1 639 cm-1處為-OH 基團(tuán)的彎曲振動(dòng)特征吸收峰，1 371 cm-1處為=CH 的變形吸收峰[26]。1 253 cm-1處為C-O-C 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)所引起的。引起注意的是，在885 cm-1處有細(xì)微的吸收峰，這是β型糖苷鍵特征吸收譜段[27]。FT-IR 圖表明該胞外多糖是以β-糖苷鍵所相連，由O-H，C-H，C-O-C 及=CH 等多種基團(tuán)組成的復(fù)雜分子。

圖7 胞外多糖傅里葉紅外光譜

2.6 胞外多糖的微觀結(jié)構(gòu)

低倍率下胞外多糖樣品表面見(jiàn)圖8。

圖8 胞外多糖SEM

由圖8（a）可以看出，胞外多糖表面是粗糙不平的結(jié)構(gòu)分布，形成的孔隙明顯低于50 μm，分子單元間強(qiáng)烈的交互作用降低其水化作用，且具有較高的抗非線性形變的能力。由圖8（b）可以看出，胞外多糖樣品的分子單元是高度無(wú)定形的三維結(jié)構(gòu)，表面褶皺度較高并同時(shí)存在因表面凹陷扭曲而形成的細(xì)微孔洞。這些分子單元通過(guò)嵌合或纏結(jié)共同形成多孔狀松散網(wǎng)格骨架結(jié)構(gòu)。推測(cè)一方面胞外多糖利用網(wǎng)格結(jié)構(gòu)吸附含于進(jìn)水中的小粒徑物質(zhì)，使其失去流動(dòng)性并留存其中。另一方面，這種以多糖分子為基本骨架所形成的凝膠，因其內(nèi)部含有氫鍵而具有較高的粘性。這種特性增加了過(guò)水的粘滯阻力，所固定的顆粒物質(zhì)與胞外多糖共同形成了膠狀淤泥。

本研究推測(cè)胞外多糖的特性粘度及其與顆粒形成的膠狀淤泥是造成堵塞的關(guān)鍵因子之一。高粘滯狀態(tài)使得基質(zhì)孔隙內(nèi)混流態(tài)，增加了短流及返混等不利水力現(xiàn)象發(fā)生的可能，從而最終延長(zhǎng)系統(tǒng)的水力停留時(shí)間同時(shí)進(jìn)水中的各種粒徑的顆粒物質(zhì)被截留的幾率大大增加，與其共同形成復(fù)合膠體，擠占孔隙空間，加深堵塞程度。馮嵩[28]提出利用殺菌劑，溶解已存在的胞外多糖，提升系統(tǒng)的水力傳導(dǎo)能力。

3 結(jié)論

（1）曝氣能夠明顯減緩胞外多糖累積速率，降低胞外多糖含量及其特性粘度。

（2）通過(guò)一系列分析方法表明胞外多糖是以β-糖苷鍵所相連，由O-H，C-H，C-O-C 及=CH 等多種基團(tuán)組成的高度無(wú)定形的復(fù)雜分子，其分子表面有褶皺，同時(shí)存在細(xì)微孔洞。據(jù)此推測(cè)胞外多糖特性粘度及其與顆粒形成的膠狀淤泥是造成堵塞的關(guān)鍵因子之一。