陳奕坤，王吐虹，翟楊，程毅，高春生，

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

苧麻（Boehmeria nivea（L.）Gaudich）是蕁麻科（Urticaceae）苧麻屬的一種多年生草本植物，原產(chǎn)于東亞，是全世界范圍內(nèi)最古老的纖維作物之一［1］。在我國，各種苧麻種類變異類型和苧麻屬野生種較多，栽培歷史悠久，因而國際上也將其稱為“中國草”。根據(jù)FAO數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計，2018年我國苧麻種植面積為5.2萬公頃，年產(chǎn)量10.4萬噸，產(chǎn)量占全世界的97.5%。苧麻具有生長速度快、產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)效益顯著等特點，具有很高的利用價值：例如其纖維品質(zhì)優(yōu)良，被譽為“天然纖維之王”［2］；其葉和嫩梢可作為蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富的飼料被廣泛利用；苧麻的麻骨還可造紙，也可制造纖維板，用于家裝中的家具和板壁；其地下部的根組織中含有“苧麻酸”可為藥用等［3］。此外苧麻副產(chǎn)物的飼料化及可生產(chǎn)多功能麻纖維膜等多用途開發(fā)，更增加了其經(jīng)濟(jì)價值［4］。

苧麻根褐腐病是由鐘器腐霉（Phytopythium vexans）為主引起的一種苧麻新病害［5］，目前在苧麻產(chǎn)區(qū)呈逐漸擴(kuò)大的趨勢，該病害造成苧麻“蘿卜根”內(nèi)部變?yōu)榧t褐色、表皮變?yōu)榧t褐色至紫黑色，嚴(yán)重時腐爛死亡，嚴(yán)重影響苧麻的生長和產(chǎn)量。鐘器腐霉是一種重要的、寄主廣泛的植物病原卵菌，隸屬于卵菌綱、霜霉目、腐霉科、腐霉屬。其除了為害苧麻，還能為害煙草、柑橘、茶葉等多種經(jīng)濟(jì)作物［6］，引發(fā)潰瘍病、冠腐病、莖腐病、根褐腐病和猝倒?。?］。

目前，苧麻根褐腐病發(fā)生日益嚴(yán)重，但國內(nèi)外缺乏有效的化學(xué)防治手段。本研究對市場上常用的殺菌劑進(jìn)行收集整理，利用含毒介質(zhì)法在室內(nèi)進(jìn)行藥效篩選試驗，篩選出了防治苧麻根褐腐病的高效殺菌劑，旨在為苧麻根褐腐病的田間防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑

參照市場上針對腐霉菌類病害常用的藥劑，選擇低毒的主流殺菌劑。從市場上收集了18種供試藥劑，分別為：苯菌靈、百菌清、甲基硫菌靈（甲拖）、克菌丹、溴菌腈、腐霉利、代森錳鋅、啶菌惡唑、氰霜唑、霜霉威、惡霉靈、70%敵磺鈉、45%敵磺鈉、精甲霜·錳鋅、多抗霉素B、湘特1號、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌（見表1）。

表1 供試藥劑信息Table 1 Information of the supplied test fungicides

1.1.2 供試病原菌

鐘器腐霉菌株HF1（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所沅江實驗站）；DZ1－1（四川省達(dá)州市農(nóng)科所）；YC2－3（江西省宜春市農(nóng)科所）；XN－2（湖北省咸寧市農(nóng)科所）；FL2－1（重慶市涪陵區(qū)農(nóng)科所），均通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法鑒定為鐘器腐霉。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，加蒸餾水至1000 mL，121°C滅菌20 min。

PARP［8］：匹馬菌素＋利福平＋安卡青霉素鈉＋五氯硝基苯。

匹馬菌素：0.05 g溶解于20 mL DMSO，交替加無菌水與DMSO定容至50 mL。過濾除菌，分裝10 mL離心管，－20°C保存。

利福平和安卡青霉素鈉：0.05 g利福平溶解于1 mL DMSO，1.25 g安卡青霉素鈉溶解于40 mL純水，溶解后將兩者混合，定容至50 mL，過濾除菌，分裝于10 mL離心管，－20°C保存。

五氯硝基苯：0.125 g五氯硝基苯溶解于5 mL DMSO，過濾除菌，4°C保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與培養(yǎng)

選取5個地區(qū)帶有典型苧麻根褐腐病的苧麻根，清洗干凈后，在無菌操作臺上進(jìn)行表面消毒。先對其凈根表面用75%酒精擦拭2遍，然后用3%的次氯酸鈉消毒5 min，再用蒸餾水清洗3遍后置于無菌濾紙上［9］。用小刀取下發(fā)病組織的病健交界處，用剪刀剪成2～3 mm方塊，置于含有PARP的PDA選擇性培養(yǎng)基平板培養(yǎng)皿中，之后靜置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為（25±1）°C。待分離的組織塊長出菌落后，選取典型的病原菌菌落，用接種針轉(zhuǎn)接到另一PDA平板中，在25°C恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)純化培養(yǎng)，2 d后在無菌條件下，用0.5 cm打孔器打成菌餅備用。

1.2.2 病原菌鑒定

采用北京聚合美生物科技有限公司提供的M5超光速MIX試劑盒 （MF848）提取鐘器腐霉DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。余永廷等［5］首次提出并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法確定了鐘器腐霉是引起苧麻根褐腐病的病原菌，可直接通過特異性引物鑒定病原菌鐘器腐霉。

（1）其特異性引物如下［10］：PvF1（5‘－TTTCCGTTTTGTGCTTGATG－3’）和 PvR1（5‘－AGCGAACACACCCAATAAGC－3’），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為147 bp。

（2）PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性 3min，95°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸1min，將變性、退火、延伸設(shè)置為34次循環(huán)，最后72°C再延伸5 min。

（3）電泳條件：130 V，180 mA，30 min。

1.2.3 藥劑的質(zhì)量濃度篩選

采用含毒介質(zhì)法［11］，所選殺菌劑參考使用說明書上提供的田間用藥濃度，選擇湖南省沅江市分離菌HF1進(jìn)行毒力初步測定。

采用二次稀釋法［12］制備含藥平板。方法如下：依據(jù)每種藥劑的實際工作濃度將藥劑配制為母液以方便操作，母液濃度為原樣濃度稀釋10～20倍最佳。將事先備好的培養(yǎng)基加熱融化并冷卻，取適量母液加入蒸餾水稀釋成目標(biāo)濃度，并加入冷卻至60°C左右的PDA培養(yǎng)基中，搖晃均勻，倒入9 mm的無菌培養(yǎng)皿。待平板凝固后，將之前保存好的鐘器腐霉菌菌株進(jìn)行活化后，打取菌柄置于帶藥平板中央，放入（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱，測量并記錄菌落值。根據(jù)18種供試藥劑的抑菌率，確定藥效較好的幾種藥劑。

初試后，選取幾種高效的殺菌劑，并觀察其藥劑在抑菌率50%上下區(qū)間范圍所對應(yīng)的稀釋濃度，每種藥劑依次從高到低選取5種濃度逐步測試，每個處理重復(fù)6次，獲取質(zhì)量濃度梯度曲線，求出其EC50（能引起50%最大效應(yīng)的濃度）。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

接種后，每12 h觀察一次菌絲生長情況，在對照培養(yǎng)皿真菌菌絲長滿培養(yǎng)皿之前，用十字交叉法進(jìn)行菌落直徑測量，并利用下列公式計算抑菌率［13］。利用Excel求出濃度的對數(shù)和抑制率，計算回歸方程及EC50值和相關(guān)系數(shù)：

抑制率（%）＝［（對照菌落直徑－0.5 cm）－（處理菌落直徑－0.5 cm）］／（對照菌落直徑－0.5 cm）×100%

1.2.5 精甲霜·錳鋅對5個主產(chǎn)區(qū)苧麻根褐腐病鐘器腐霉菌毒力測定

對已篩選出的最好的高效殺菌劑精甲霜·錳鋅，測定其對5個主產(chǎn)區(qū)苧麻根褐腐病菌的抑菌效果。配制適宜的精甲霜·錳鋅濃度，采用生長速率法，在含藥平板上分別接種湖北、江西、四川、重慶、湖南5地分離的鐘器腐霉菌，測量其菌落直徑并計算抑菌率。每個地區(qū)3次接菌重復(fù)，不加藥培養(yǎng)基作空白對照，依次測定精甲霜·錳鋅對各個地區(qū)苧麻根褐腐病菌的抑菌率。并采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定結(jié)果

從苧麻病根分離出的病原菌，經(jīng)特異性引物PvF1和PvR1擴(kuò)增，凝膠電泳條帶見圖1，CK為陰性對照（做PCR體系時不加DNA模板），特異性引物擴(kuò)增條帶為147 bp，圖中目的條帶與預(yù)期相符，確定已分離的5個地區(qū)根褐腐病病原菌為鐘器腐霉。

圖1 5個地區(qū)苧麻根褐腐病病原菌DNA特異性引物PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1 PCR amplification of DNA from ramie root rot in 5 regions using specific primers

2.2 室內(nèi)藥劑初篩試驗結(jié)果

對供試鐘器腐霉菌株HF1進(jìn)行殺菌劑初篩，取不加任何藥劑平板中的HF1生長直徑為對照，表2結(jié)果表明，18種殺菌劑對鐘器腐霉HF1的抑制作用存在差異，其中代森猛鋅、啶菌惡唑、精甲霜·錳鋅、克菌丹、溴菌腈對鐘器腐霉HF1具有非常好的抑制作用，對苧麻根褐腐病菌的抑制率達(dá)100%。當(dāng)對照的鐘器腐霉HF1菌落直徑為5.96 cm時，添加了上述5種藥劑的平板上菌株完全不生長。苯菌靈、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉對鐘器腐霉HF1抑制效果不明顯。

2.3 殺菌劑效果數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3.1 5種高效殺菌劑室內(nèi)毒力測定分析

初篩防效較好的藥劑有代森猛鋅、啶菌惡唑、精甲霜·錳鋅、克菌丹、溴菌腈，其殺菌毒力測定統(tǒng)計數(shù)據(jù)通過Excel分析，計算出5種殺菌劑的EC50值。5種殺菌劑對鐘器腐霉HF1殺菌效果的線性回歸方程統(tǒng)計分析如表3。

表2 8種殺菌劑對鐘器腐霉菌株HF1的抑制率Table 2 Inhibition rate of 18 fungicides on P．vexans HF1

表3 5種殺菌劑的回歸方程Table 3 Regression equation of five fungicides

從表3數(shù)據(jù)可以看出，精甲霜·錳鋅的EC50最小，為1.004 mg／L，然后依次是克菌丹、代森錳鋅、溴菌腈、啶菌惡唑，EC50分別為 13.740、27.830、56.260、190.570 mg／L。根據(jù)抑菌毒力回歸方程，藥劑的濃度和抑制率呈正相關(guān)，R體現(xiàn)了殺菌劑對鐘器腐霉的抑菌率和殺菌劑的濃度之間呈現(xiàn)正相關(guān)性的密切程度，相關(guān)系數(shù)R2均在0.9～1.0之間，說明5種藥劑抑菌率和殺菌劑濃度相關(guān)程度很高。數(shù)據(jù)結(jié)果同時表明，精甲霜·錳鋅的抑制效果最好，其抑菌效果遠(yuǎn)高于其他藥劑，其次為克菌丹、代森錳鋅、溴菌腈，而啶菌惡唑的抑菌效果在5種藥劑中最差。

2.3.2 精甲霜·錳鋅對5個地區(qū)的鐘器腐霉菌的抑菌效果及其差異顯著性

測定5個主產(chǎn)區(qū)苧麻根褐腐病菌在精甲霜·錳鋅作用下的抑菌情況，采用生長速率法，在含藥平板上接菌，測量其菌落直徑，重復(fù)3次，取抑菌率平均值。由表4可知，精甲霜·錳鋅對5個主產(chǎn)區(qū)苧麻根褐腐病菌的抑菌率在93.75%～96.93%之間，其抑菌率差異不顯著，不同地區(qū)的鐘器腐霉菌株對同一種殺菌劑抗性無明顯差異。

表4 精甲霜·錳鋅對不同地區(qū)鐘器腐霉菌株的抑菌率均值統(tǒng)計結(jié)果及差異Table 4 The statistical results and differences of themean value of the inhibitory rate ofmetalaxylmancozeb against P．vexans in different regions

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，苧麻除傳統(tǒng)上用作紡織原料、動物飼料外，很多新的領(lǐng)域（如藥用、生物降解薄膜等）得到開發(fā)利用。因其高市場活躍度、歷史文化的深厚底蘊、特色的苧麻產(chǎn)區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展模式、廣泛而優(yōu)良的多功能應(yīng)用途徑［15］等特點，苧麻在農(nóng)產(chǎn)品的高質(zhì)量發(fā)展中有十分重要的地位。由鐘器腐霉為主引起的根褐腐病作為苧麻生產(chǎn)上的重要病害，對其進(jìn)行有效防治至關(guān)重要。本研究選取了市場上常用的18種腐霉類殺菌劑，對鐘器腐霉進(jìn)行毒力測定，為苧麻根褐腐病化學(xué)藥劑防治提供了重要的理論參考。研究結(jié)果表明，精甲霜·錳鋅的室內(nèi)測定抑制效果最好，該結(jié)果與前人研究報道［16］篩選出的防治其他卵菌的有效藥劑一致。研究結(jié)果為田間大面積防治苧麻根褐腐病藥劑選擇提供了參考依據(jù)，除精甲霜·錳鋅外，克菌丹、代森錳鋅、溴菌腈、啶菌惡唑在鐘器腐霉生長初期的抑菌率達(dá)100%。其他如苯菌靈、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉等藥劑室內(nèi)測定對苧麻根褐腐病鐘器腐霉幾乎無明顯作用，可在實際用藥時規(guī)避，避免無效施藥。

國內(nèi)苧麻5個主產(chǎn)區(qū)的苧麻根褐腐病菌－鐘器腐霉對精甲霜·錳鋅的抗藥性試驗結(jié)果顯示，不同地區(qū)的苧麻根褐腐病病菌對同一種殺菌劑的抗性無明顯差異，這在實際用藥中可以更好地預(yù)測用藥效果，對其防治有一定的理論依據(jù)，也確定了精甲霜·錳鋅等藥劑適用于不同地區(qū)的鐘器腐霉防治。在試驗過程中，也進(jìn)行了不同地區(qū)對其他試劑的殺菌性差異比較，其結(jié)果與精甲霜·錳鋅試驗結(jié)果一致。雖然精甲霜·錳鋅的抑菌效果顯著，但為了防止使用同一種殺菌劑形成病原菌的抗藥性［17］，同時推薦代森猛鋅、克菌丹、溴菌腈、啶菌惡唑藥劑輪換施藥。

本研究明確了室內(nèi)抑制鐘器腐霉有效的藥劑，但是對于大田根褐腐病菌是否有效有待進(jìn)一步試驗研究。此外，在研究中發(fā)現(xiàn)不僅是鐘器腐霉可導(dǎo)致苧麻發(fā)生病變，線蟲也可導(dǎo)致其病變，甚至一株苧麻病變可能由兩個病變因子引起［18］。故如能研制出對線蟲和鐘器腐霉菌均有效的殺菌劑將更有意義。