董 旭，孫明娜，褚 玥，童 舟，王 梅，段勁生，高同春

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（合肥），合肥 230031）

丙硫菌唑（prothioconazole），其分子式為C14H15Cl2N3OS（圖1（a）），化學(xué)名稱為(RS)-2-[2-(1-氯環(huán)丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羥基丙基]-2，4-二氫-1,2,4-三唑-3-硫酮，是一種新型三唑類廣譜殺菌劑，由拜耳作物科學(xué)公司（德國）研發(fā)生產(chǎn)。自2004年始，先后在德國、英國、澳大利亞、法國、美國、加拿大等國取得登記，于2018年12月在我國獲準(zhǔn)登記。丙硫菌唑作為一種高效廣譜殺菌劑，主要用于防治谷類、麥類、豆類等由擔(dān)子真菌、子囊菌、半知菌等真菌引起病害的作物，其作用機(jī)理是通過抑制真菌甾醇前體，導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜功能、形態(tài)等發(fā)生變化[1-4]。相對于傳統(tǒng)殺菌劑，丙硫菌唑不僅有良好的內(nèi)吸活性，而且持效期長，另外具有較高的防病效果。通過對丙硫菌唑的苯環(huán)和三唑環(huán)C14標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，在室外環(huán)境中施藥后丙硫菌唑在作物和土壤中受光照、溫度、濕度、pH、微生物等因子影響，快速脫硫代謝為脫硫丙硫菌唑[5]（圖1（b））。目前，與丙硫菌唑相關(guān)研究報道多為其在土壤、水果、蔬菜、小麥、動物源產(chǎn)品等中的殘留情況，其相關(guān)的室內(nèi)土壤降解研究未見報道[6-8]。

圖1 丙硫菌唑和脫硫丙硫菌唑結(jié)構(gòu)式

目前我國農(nóng)藥有效利用率約為30%，大部分農(nóng)藥通過各種形式最終進(jìn)入土壤、地下水等環(huán)境介質(zhì)。農(nóng)藥進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)后在微生物、光照、溫度等條件影響下發(fā)生降解、移動等行為，因此，判斷某種農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境是否安全，可以通過其在土壤中的降解特性進(jìn)行評價[9]。農(nóng)藥在土壤中的降解特性除了與化合物本身的理化性質(zhì)有關(guān)外，還與土壤的pH值、土壤類型、土壤有機(jī)質(zhì)含量、土壤微生物量等環(huán)境因子密切相關(guān)。筆者在實驗室條件下研究了不同類型土壤中丙硫菌唑的降解特征，并研究了好氧、厭氧、模擬水稻田條件對其降解速率的影響，旨在為其環(huán)境安全性評價提供參考[10-12]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

97.0%丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)品和99.5%脫硫丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.EhrenstorferGmbh公司；無水硫酸鈉（分析純）、氯化鈉（分析純），甲醇、乙腈（色譜級）、Carb/NH2固相萃取小柱（Carb 300 mg/NH2，500 mg/6 mL），美國安捷倫科技有限公司。

LC-MS-8030超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；Milli-Q Direct 8超純水機(jī)，德國默克密理博公司；Y-4恒溫振蕩器，江蘇金壇金城國勝試驗儀器廠；R-100旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)器，瑞士步琦儀器設(shè)備有限公司；390HE電子天平，瑞士普利賽斯公司。

1.2 供試土壤

分別從安徽、江西和吉林采集有代表性的耕作層土壤（安徽選擇水稻土、江西選擇紅土、吉林選擇黑土），采集后陰干除去土壤中殘留的根系、石塊等雜質(zhì)，再粉碎、陰干、過篩（2 mm），保存于2～4℃避光環(huán)境中備用，保存期為6個月。土壤理化性質(zhì)見表1。

表1 土壤理化性質(zhì)

1.3 檢測方法

色譜柱：Shim-pack XR-ODS-Ⅲ，2.0 mm×50 mm，1.6 μm；流動相A：5 mmol/L乙酸銨＋0.02%甲酸（體積比）的水溶液，流動相B：乙腈；柱溫40℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。梯度洗脫：初始B相15%；0～1.5 min，B相15%～95%；1.5～3.0 min，B相保持95%；3.1 min，B相降為15%；3.1～5.0 min，B相保持15%。

離子源：ESI（±）；接口電壓：＋4.5 kV；霧化氣：氮氣3.0 L/min；干燥氣：15 L/min；碰撞氣：氬氣，230 Ka；脫溶劑管溫度：250℃；加熱模塊溫度：450℃；丙硫菌唑及其脫硫丙硫菌唑質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)見表2。

1.4 土壤前處理方法

取樣凍干，稱取凍干土壤樣品20 g于錐形瓶中，加入乙腈和水（V∶V=40∶10）混合溶液50 mL，放入恒溫振蕩器中，室溫下（25℃）振蕩提取40 min；取出加入4～5 g氯化鈉后繼續(xù)在室溫下振搖5 min，將提取液全部過濾轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4 500 r/min下離心3 min，室溫靜置20 min；取上清液2 mL至裝有100 mg無水MgSO4及100 mg PSA吸附劑的10 mL離心管中，3 000 r/min渦旋1～2 min，取出放入離心機(jī)中，于5 500 r/min下離心5 min；過0.22 m濾膜，待測。

表2 丙硫菌唑及其脫硫丙硫菌唑質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

1.5 丙硫菌唑及脫硫丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取97%丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)品、99.5%脫硫丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜乙腈做溶劑，配制供試物標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，保存于-20℃避光環(huán)境。試驗前用色譜乙腈稀釋1組5.0～0.005 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.3檢測方法進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 丙硫菌唑及脫硫丙硫菌唑添加回收試驗

選擇空白安徽水稻土、江西紅土和吉林黑土，分別添加丙硫菌唑和脫硫丙硫菌唑標(biāo)液，試驗設(shè)3個添加5次重復(fù)，按1.4的處理方法和1.3的檢測方法分析，分別計算丙硫菌唑、脫硫丙硫菌唑回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.7 試驗方法

1.7.1 土壤預(yù)培養(yǎng)（好氧及厭氧實驗）

室溫下（25±2℃）稱取適量3種試驗用土壤樣品，在好氧及厭氧條件試驗中均不少于2 kg，均勻噴入超純水，潤濕后混勻，加水至土壤飽和持水量的40%，置恒溫培養(yǎng)箱中鼓風(fēng)，避光培養(yǎng)14 d（記錄溫度范圍24.7～25.2℃）。為保持初始持水狀態(tài)，預(yù)培養(yǎng)過程中需及時補(bǔ)水。

1.7.2 供試物水溶液配制

取10 000 μg/mL的丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用超純水稀釋成1 000 μg/mL水溶液，于2～4℃避光環(huán)境中保存。

1.7.3 好氧降解試驗

分別稱取安徽水稻土、江西紅土和吉林黑土各20 g（精確到0.01 g）于250 mL棕色瓶中，取配置好的丙硫菌唑水溶液，均勻滴加200 μg至土壤表面，待水分揮發(fā)后，渦旋混勻，使丙硫菌唑均勻分布土壤中，此時其初始質(zhì)量比為10 μg/g。調(diào)節(jié)土壤飽和持水量至60%，硅膠塞（帶砂芯）蓋上瓶口，置于恒溫培養(yǎng)箱（25℃）中鼓風(fēng)避光培養(yǎng)1個丙硫菌好氧半衰期（記錄溫度范圍24.1～25.3℃）。實驗設(shè)置2個重復(fù)，上述條件下分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、16 h，1、2、3、4、5、7、10、14、21、30、45、60、90 d。選擇另一恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置空白對照樣品。取樣后及時測定，或?qū)悠分糜?20℃下避光保存。

1.7.4 厭氧降解試驗

分別稱取安徽水稻土、江西紅土和吉林黑土各20 g（精確到0.01 g）于250 mL棕色瓶中，取配置好的丙硫菌唑水溶液，均勻滴加200 μg至土壤表面，待水分揮發(fā)后，渦旋混勻，使丙硫菌唑均勻分布土壤中，此時其初始質(zhì)量比為10 μg/g。調(diào)節(jié)其土壤飽和持水量至60%，硅膠塞（帶砂芯）蓋上瓶口，置于恒溫培養(yǎng)箱（25℃）中鼓風(fēng)避光培養(yǎng)1個丙硫菌唑好氧半衰期（記錄溫度范圍24.7～25.6℃）；取出后加超純水至液面約1～3 cm后通入氮氣，恒溫恒濕（溫度25℃、相對濕度60%），避光培養(yǎng)（記錄溫度范圍24.8～25.2℃、相對濕度范圍59%～62%）。實驗設(shè)置2個重復(fù)，上述條件下分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、16 h，1、2、3、4、5、7、10、14、21、30、45、60、90 d。選擇另一恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置空白對照樣品。取樣后及時測定，或?qū)悠分糜?20℃下避光保存。

1.7.5 水稻田厭氧降解試驗

室溫下（25±2℃）分別稱取安徽水稻土、江西紅土和吉林黑土各50 g（精確到0.01 g）于250 mL棕色瓶中，加超純水至土壤表面積存0.5～1.0 cm，放入通氮系統(tǒng)，設(shè)置恒溫恒濕培養(yǎng)箱溫度25℃，相對濕度60%，避光培養(yǎng)14 d（記錄溫度范圍24.2～25.7℃、相對濕度范圍58%～61%）。用移液器向土層中均勻加入500 μg丙硫菌唑，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（記錄溫度范圍24.9～25.6℃、相對濕度范圍59%～61%）。實驗設(shè)置2個重復(fù)，上述條件下分別培養(yǎng)0、2、6 h，1、3、5、7、14、21、30、45、60、90、120 d。選擇另一恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置空白對照樣品。取樣后及時測定，或?qū)悠分糜?20℃下避光保存。

1.8 數(shù)據(jù)處理

1.8.1 丙硫菌唑殘留

丙硫菌唑室內(nèi)土壤降解實驗在恒溫避光條件下進(jìn)行，為保證實驗的準(zhǔn)確性，其殘留量總量按式（1）計算：

式中：C為丙硫菌唑殘留總量；Ca、Cb分別為丙硫菌唑、脫硫丙硫菌唑的殘留量；R為母體分子量與代謝物分子量比值，取R=1.102 7。

設(shè)丙硫菌唑和代謝產(chǎn)物脫硫丙硫菌唑的檢測限分別為La、Lb，丙硫菌唑殘留總量計算分以下4種情況：

（1）若Ca≥La，Cb≥Lb，則C=Ca＋1.102 7 Cb；

（2）若Ca＜La，Cb≥Lb，則C=La＋1.102 7 Cb；

（3）若Ca≥La，Cb＜Lb，則C=Ca＋1.102 7 Cb·Lb；

（4）若Ca＜La，Cb＜Lb，則C=0。

1.8.2 半衰期計算土壤中丙硫菌唑的降解按一級動力學(xué)方程ct=c0e-kt進(jìn)行擬合，降解半衰期按t1/2=ln2/k計算。

1.9 土壤降解等級劃分

丙硫菌唑在土壤中的降解特性等級參照GB T 31270.1—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[13]進(jìn)行劃分。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍、準(zhǔn)確度及精密度

丙硫菌唑及脫硫丙硫菌唑在0.005～5 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度間線性關(guān)系均良好。線性方程：①丙硫菌唑，y=330 826.249 3 x＋42 861.959 3，r=0.997；②脫硫丙硫菌唑，y=1 181 676.611 3 x＋192 452.531 3，r=0.996，添加水平在0.08～10 μg/g范圍內(nèi)。丙硫菌唑在3種土壤中的平均回收率為83.6%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.40%～5.86%；脫硫丙硫菌唑在3種土壤中的平均回收率為80.1%～98.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%～9.56%。丙硫菌唑及脫硫丙硫菌唑在3種土壤中的最低檢出量均為0.08 μg/g，丙硫菌唑、脫硫丙硫菌唑的最低檢出限均為2.5×10-11g。儀器對丙硫菌唑的最低檢出限為1×10-11g，脫硫丙硫菌唑為5×10-12g（以3倍信噪比計算），滿足殘留試驗準(zhǔn)則要求[14]。結(jié)果見表3、表4。

表3 丙硫菌唑的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

表4 脫硫丙硫菌唑的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

表5 丙硫菌唑好氧降解參數(shù)

2.2 好氧條件降解特性

丙硫菌唑在土壤中降解半衰期由小到大依次為黑土（13.3 d）、水稻土（17.6 d）、紅土（18.9 d）（表5）。試驗中3種供試土壤的pH值、有機(jī)質(zhì)及黏粒含量均不相同。在本實驗條件下，降解半衰期隨土壤有機(jī)質(zhì)及黏粒含量增加而縮短（圖3），降解動態(tài)曲線符合一級動力學(xué)方程。

施用丙硫菌唑后很快形成脫硫代謝產(chǎn)物脫硫丙硫菌唑，通過母體苯環(huán)C14標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，其經(jīng)化學(xué)或生物作用逐步分解，最后在土壤中礦化生成二氧化碳，并被植物吸收后進(jìn)入自然循環(huán)狀態(tài)[15]。與自然環(huán)境相比，室內(nèi)土壤降解試驗主要與土壤本身的有機(jī)質(zhì)含量、pH值及粒徑分布等因子有關(guān)[16]。高有機(jī)質(zhì)含量的土壤利于微生物生長繁殖，豐富的微生物數(shù)量和種群加速農(nóng)藥在土壤中的降解（圖2、圖3）[17]。

圖2 丙硫菌唑好氧降解曲線

圖3 好氧條件下丙硫菌唑降解速率隨有機(jī)質(zhì)含量和黏粒含量的變化趨勢

2.3 厭氧條件降解特性

厭氧條件下丙硫菌唑降解速率低于好氧條件，降解半衰期由小到大依次為黑土（30.3 d）、水稻土（41.5 d）、紅土（53.1 d）（表6）。

表6 丙硫菌唑厭氧降解參數(shù)

厭氧實驗先經(jīng)過氧培，這一階段土壤中好氧微生物的生物活性沒有改變，而后加水至1～3 cm高，并通入氮氣使實驗系統(tǒng)處于厭氧環(huán)境，此時土壤表面積水、氧氣交換能力減弱，持續(xù)通入的氮氣使得土層和水層含氧量逐漸降低，抑制了好氧微生物的活性，因此與好氧條件相比，丙硫菌唑在3種土壤中的半衰期均有不同程度的延長，但降解半衰期也是隨土壤有機(jī)質(zhì)及黏粒含量增加呈縮短趨勢（圖4、圖5）[18-19]。

圖4 丙硫菌唑厭氧降解曲線

圖5 厭氧條件下丙硫菌唑降解速率隨有機(jī)質(zhì)含量和黏粒含量的變化趨勢

2.4 水稻田厭氧降解特性

與好氧及厭氧條件相比，丙硫菌唑降解半衰期均有所延長，降解半衰期從小到大依次為黑土（32.2 d）、水稻土（45.3 d）、紅土（54.7 d）（表7）。

表7 丙硫菌唑水稻田厭氧降解參數(shù)

土壤降解主要以微生物降解和水解為主，積水厭氧條件下，不斷通入的氮氣逐漸降低系統(tǒng)中氧氣的含量，抑制了土壤中好氧微生物的活性，降低了微生物對農(nóng)藥的降解能力，丙硫菌唑的降解半衰期得到不同程度的延長[17-19]。積水厭氧條件下，3種供試土壤的有機(jī)質(zhì)含量、pH值及粒徑等存在差異，使得丙硫菌唑降解速率有所不同。此時，土壤pH值對農(nóng)藥的水解作用也有一定的影響，但降解半衰期亦隨土壤有機(jī)質(zhì)及黏粒含量增加呈縮短趨勢（圖6、圖7）。

圖6 丙硫菌唑水稻田厭氧降解曲線

圖7 水稻田厭氧條件下丙硫菌唑降解速率隨有機(jī)質(zhì)含量和黏粒含量的變化趨勢

3 結(jié) 論

研究表明，本實驗條件下，在安徽水稻土、江西紅土和吉林黑土中丙硫菌唑總殘留量均隨培養(yǎng)時間延長而降低。在好氧、厭氧及水稻田厭氧3種條件下，半衰期為13.3～54.7 d。在吉林黑土中丙硫菌唑降解最快，在江西紅土中降解最慢，降解速率與土壤有機(jī)質(zhì)及黏粒含量呈正相關(guān)性。

結(jié)果表明，好氧條件下丙硫菌唑在安徽水稻土、江西紅土、吉林黑土中均屬易降解；厭氧條件下其在安徽水稻土、江西紅土、吉林黑土均屬中等降解；水稻田厭氧條件下其在安徽水稻土、江西紅土、吉林黑土也均屬中等降解。