李寧　肖婷　章騫　陳曉梅　陳曦

摘 要 傳統(tǒng)的肉類新鮮度指示卡采用pH型指示劑，受環(huán)境因素影響大，容易造成假陽性結(jié)果。本研究以麥氏酸活化呋喃 （Meldrum′s activated furan， MAF）為揮發(fā)性胺指示劑，聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）為載體，設(shè)計了一種用于檢測魚肉新鮮度的MAF/PVC薄膜。通過旋轉(zhuǎn)涂布法制備薄膜，以NH3為模型物，考察了薄膜的傳感性能。結(jié)果表明，MAF質(zhì)量含量為15%、旋轉(zhuǎn)涂布速度為2000 r/min時制得的薄膜對NH3傳感效果最好。以MAF/PVC薄膜為新鮮度指示卡，貼于裝有鮮魚肉的托盤包裝內(nèi)。測定MAF/PVC薄膜的亮度（L）、紅色度（a）、黃色度（b）值，并根據(jù)MAF/PVC薄膜響應(yīng)前后的L、a、b值計算色差值（ΔE）; 同時，測定魚肉樣品中的總揮發(fā)性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen， TVB-N）含量。結(jié)果表明，MAF/PVC薄膜的ΔE值變化趨勢與樣品中TVB-N含量具有良好的相關(guān)性，可準確、快速指示魚肉的新鮮度，在水產(chǎn)品新鮮度檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 新鮮度指示卡; 魚肉; 麥氏酸活化呋喃

1 引 言

新鮮度是評價水產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，對水產(chǎn)品品質(zhì)及原料的加工適性有重要影響。水產(chǎn)品新鮮度評價方法主要包括常規(guī)的感官評價法、微生物檢測法[1]、高效液相色譜法[2]，以及近年來發(fā)展起來的電子鼻[3]、電子舌[4]和高光譜成像法等[5]。但這些方法普遍存在樣品前處理過程復(fù)雜、操作繁瑣、成本高等缺點，難以滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。相比較而言，新鮮度指示器法可以通過直觀的顏色變化反映包裝內(nèi)部食品的新鮮程度，是一種小尺寸、低成本的無損檢測技術(shù)，在水產(chǎn)品新鮮度檢測中具有較好的應(yīng)用潛力[6，7]。

食品在變質(zhì)過程中，其蛋白質(zhì)腐敗分解形成氨基酸后，在假單胞菌等的作用下發(fā)生脫氨、脫羧反應(yīng)，產(chǎn)生大量揮發(fā)性胺如氨氣、三甲胺等，這些胺的存在會使包裝空間內(nèi)pH值上升，研究者據(jù)此開發(fā)了一系列的新鮮度指示器。Zhang等[8]以洋紫荊花提取的天然染料作為指示劑，實現(xiàn)對豬肉和魚肉腐敗程度的檢測。Kuswandi等[9]以甲基紅和溴甲酚紫作為指示劑，實現(xiàn)對牛肉新鮮度的檢測。Dudnyk等[10]從卷心菜中提取花色苷作為指示劑，設(shè)計以果膠為載體的新鮮度傳感器，用于檢測牛肉和牙鱈的新鮮度。由于這些新鮮度指示器采用的指示劑均為pH敏感型材料，容易受到溫度、濕度、干擾氣體等環(huán)境因素的影響，造成指示劑顯色不準確。因此，開發(fā)對揮發(fā)性胺具有高特異性、靈敏響應(yīng)的傳感材料，是實現(xiàn)準確檢測食品新鮮度的重要途徑。

給體-受體斯坦豪斯加合物（Donor-acceptor Stenhouse adducts，DASAs）是一類新穎的光敏感分子，2014年由加州大學(xué)圣芭芭拉分校Read de Alaniz課題組首次合成[11]。在長波長光（可見光或近紅外光）的作用下，DASAs可發(fā)生鏈狀與環(huán)狀變換，產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)。研究表明，麥氏酸活化的呋喃（Meldrum′s activated furan， MAF）可與胺類化合物發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，形成高摩爾光吸收的DASAs[12，13]，這為制備魚肉鮮度標(biāo)簽提供了良好的理論依據(jù)。聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）是一種熱塑性材料，具有無毒、重量輕、成本低及加工簡單等特性，廣泛應(yīng)用于工業(yè)制品、食品包裝及化學(xué)傳感等領(lǐng)域[14～17]。

本研究以MAF為揮發(fā)性胺的指示劑，PVC為載體，通過旋涂法制備MAF/PVC薄膜，以NH3為揮發(fā)性胺的模型物，優(yōu)化了薄膜的制備條件。利用MAF/PVC薄膜對魚肉新鮮度進行檢測，并以樣品總揮發(fā)性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen， TVB-N）含量變化趨勢為參照，評價薄膜的檢測性能，為此薄膜的進一步推廣應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

S-4800掃描電子顯微鏡（日本日立株式會社）; ALPHA II傅立葉紅外光譜分析儀（德國布魯克公司）;? Easycoater 4旋轉(zhuǎn)涂布機（江陰市佳圖科技有限公司）; ME 204分析天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司）; 半微量凱氏定氮儀（金壇市晶玻實驗儀器廠）; Arium comfort II超純水系統(tǒng)（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）; RE52-AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

丙二酸環(huán)異丙酯（純度98%）、甲胺（純度33%）、三甲胺（純度20%）（美國Sigma-Aldrich公司）; PVC（K-value 72-71）、糠醛（純度99%）、四氫呋喃（純度99%）（上海麥克林生化有限公司）; 載玻片（鹽城飛舟玻璃有限公司）。 其它溶劑及無機鹽均為市售分析純試劑。白鯽魚、鱸魚購于廈門集美農(nóng)貿(mào)市場; 實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

2.2 實驗方法

2.2.1 MAF的制備 采用一鍋法合成MAF[11]。分別稱取961 mg丙二酸環(huán)異丙酯和1.51 g糠醛，加入純水中，75℃攪拌2 h，得到黃色沉淀。過濾，收集沉淀，用二氯甲烷溶解。將得到的溶液分別用飽和NaHSO3溶液、水、飽和NaHCO3溶液、飽和NaCl溶液萃取，有機層用無水MgSO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到亮黃色晶體。

2.2.2 MAF/PVC薄膜的制備 將0.8 g PVC加入10 mL 四氫呋喃中攪拌至完全溶解，再加入0.5～2.5 g MAF攪拌混勻，制成薄膜前驅(qū)液。將載玻片切割成2.5 cm ×2.5 cm的矩形后，分別用乙醇、丙酮和水超聲處理30 min，氮氣吹干，備用。取600 μL前驅(qū)液滴加到處理后的載玻片上，使用旋轉(zhuǎn)涂布機進行涂布，室溫干燥后，將MAF/PVC薄膜從載玻片上分離并進行裁剪。

2.2.3 MAF/PVC薄膜的微觀形貌及紅外光譜表征 用S-4800型掃描電子顯微鏡觀察MAF/PVC薄膜的表面及橫切面結(jié)構(gòu)并拍照，測量前將薄膜真空濺射噴金處理，加速電壓為15 kV。

用ALPHA II型傅立葉紅外光譜儀在透射模式下測定指示膜的紅外吸收光譜， 掃描范圍為550～4000 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描次數(shù)為3次。

2.2.4 MAF/PVC薄膜對NH3的顏色響應(yīng) 選擇NH3作為揮發(fā)性胺的模型物。首先，將5 g氨水置于50 mL密閉小瓶中，同時在氨水上方放置棉球，以保持恒定的飽和蒸氣壓，平衡過夜，得到飽和氨蒸氣。其次，將MAF/PVC薄膜置于相同規(guī)格的透明小瓶的頂部，再分別向瓶中注入不同濃度的氨蒸氣[18]。響應(yīng)5 min后立即取出薄膜，在恒定照明條件下，使用數(shù)碼相機捕獲薄膜圖像。最后，利用Photoshop CS6軟件提取薄膜的亮度（L）、紅色度（a）、黃色度（b）的數(shù)值，并根據(jù)MAF/PVC薄膜響應(yīng)前后的L、a、b值，按照公式（1）計算色差值（ΔE）：

其中，L1、a1、b1為薄膜響應(yīng)前的數(shù)據(jù)，L2、a2、b2為薄膜響應(yīng)后的數(shù)據(jù)。

2.2.5 MAF/PVC薄膜的選擇性 將MAF/PVC薄膜分別置于裝有甲胺、三甲胺、氨水、乙酸、乙醇和H2S的密閉小瓶中，5 min后取出，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

2.2.6 MAF/PVC薄膜的穩(wěn)定性 將薄膜浸沒在pH 2.0～12.0的緩沖溶液中，5 min后記錄相關(guān)數(shù)據(jù); 將薄膜置于室溫下存儲，每隔兩天進行一次NH3響應(yīng)實驗，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，持續(xù)14 d。

2.2.7 魚肉樣品新鮮度檢測 將鮮魚剔除魚頭、內(nèi)臟、尾部及魚鰭部分，再用無菌刀具將魚肉切成重約30 g的長方體，將樣品置于貼有MAF/PVC薄膜的無菌培養(yǎng)皿中?？疾毂∧ぴ?5℃和4℃對魚肉的鮮度響應(yīng)。25℃下每隔12 h，4℃下每隔24 h，提取MAF/PVC薄膜的色差值。同時按照GB/T 5009.228-2016《食品安全國家標(biāo)準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[19]，利用半微量定氮法測定樣品的TVB-N含量，平行測定3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 比色法檢測揮發(fā)胺的原理

MAF/PVC薄膜的組裝和檢測揮發(fā)性胺的原理如圖1所示。揮發(fā)性胺可與包埋在PVC材料中的MAF迅速反應(yīng)，形成高度著色的DASAs，薄膜的顏色由淡黃色變?yōu)樽霞t色，并且薄膜顏色變化程度與揮發(fā)性胺濃度相關(guān)，因此，通過裸眼觀察或測定MAF/PVC薄膜的色差值ΔE可對揮發(fā)性胺的濃度進行定量檢測。此外，DASAs雖是光響應(yīng)染料，但當(dāng)供體為堿性時（如氨、三甲胺等），染料僅在強非極性基質(zhì)（如甲苯、三氯甲烷等）中才能漂白[20，21]，因此，本研究所生成的DASAs可以保持穩(wěn)定的顯色。

3.2 MAF/PVC薄膜的形貌表征

MAF/PVC薄膜的表面和橫截面的掃描電鏡圖如圖2所示。由圖2A可見，室溫干燥后，薄膜表面平整，說明MAF可以均勻分散到PVC中。薄膜表面分布著較多孔洞，孔徑均一，約為2 μm，揮發(fā)性胺可通過這些孔洞，與薄膜內(nèi)的MAF反應(yīng)，觸發(fā)顯色。由圖2B可知，所制得的MAF/PVC薄膜橫截面光滑且均勻，表明MAF和PVC之間具有良好的相容性，厚度約為（40±1.2） μm，說明在所選擇的涂布條件下，得到的薄膜厚度均勻，這有助于MAF/PVC薄膜顯色的均一性。

3.3 紅外光譜分析

紅外光譜可以提供傳感膜表面的官能團信息，本研究分別測定了PVC薄膜、MAF以及暴露于NH3前后MAF/PVC薄膜的紅外圖譜。如圖3所示，MAF在1026、1283和1717 cm-1處出現(xiàn)紅外吸收峰，對應(yīng)于COC對稱伸縮振動、COC不對稱伸縮振動和CO伸縮振動。將MAF包埋在PVC中，制成MAF/PVC薄膜后，薄膜的紅外吸收峰分別對應(yīng)于PVC膜和MAF的特征吸收峰，表明MAF被成功包裹在PVC膜中; 同時，MAF被包埋前、后的紅外吸收峰位置未出現(xiàn)偏移，說明MAF分子與PVC之間不是通過化學(xué)鍵合作用連接的，很好地保留了MAF的分子結(jié)構(gòu)，為后續(xù)MAF與揮發(fā)性胺反應(yīng)生成DASAs提供了有利條件。比較與NH3反應(yīng)前、后的MAF/PVC薄膜紅外吸收曲線，后者在1190 cm-1出現(xiàn)吸收峰，對應(yīng)于CN伸縮振動; 在3300～3500 cm-1有一個寬的吸收帶，為NH的伸縮振動。這些數(shù)據(jù)表明，MAF與NH3發(fā)生了開環(huán)反應(yīng)，生成了高摩爾吸光系數(shù)的DASAs，為后續(xù)MAF/PVC薄膜的顯色提供了依據(jù)。

3.4 實驗條件優(yōu)化

3.4.1 MAF濃度的優(yōu)化 為了簡化實驗，使用NH3為模型進行探究。考察了前驅(qū)液中MAF質(zhì)量濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%時制得的MAF/PVC薄膜暴露在濃度為76 mg/m3 NH3中的響應(yīng)結(jié)果。在MAF含量較少時，所能形成的DASAs量較少，導(dǎo)致薄膜的顏色變化不明顯，ΔE值較小。當(dāng)MAF質(zhì)量濃度為時15%，薄膜顏色變化最明顯，ΔE=17.62±0.22。繼續(xù)提高MAF含量，黃色的MAF造成薄膜本底顏色加深，ΔE值下降，且由于PVC含量下降，MAF/PVC薄膜的韌性降低，影響了薄膜的后續(xù)使用。因此，本研究選擇MAF質(zhì)量濃度為15%的前驅(qū)液。

3.4.2 旋涂速度的優(yōu)化 在前驅(qū)液中MAF含量相同的情況下，控制旋涂速度分別為1000、1500、2000、2500和3000 r/min，考察所制得的MAF/PVC薄膜的厚度及其對濃度為76 mg/m3 NH3的響應(yīng)情況。

如圖4所示，旋涂速度為2000 r/min時，制得的薄膜顏色變化最明顯，ΔE=17.21±0.21，結(jié)合SEM分析，此時薄膜厚度為（40.0±1.7） μm。增大旋涂速度，薄膜的厚度降低，在3000 r/min時，制得的薄膜厚度僅為（17.0±1.8） μm，且薄膜機械強度較低，很難從載玻片上完整剝離，給后續(xù)使用帶來不便。旋涂速度較低時，涂布機提供的離心力不足以使前驅(qū)液均勻分布在載玻片上，導(dǎo)致薄膜各處薄厚不均，影響了薄膜在顯色時的均一性，造成ΔE值誤差較大。相較而言，轉(zhuǎn)速為2000 r/min時，MAF/PVC薄膜厚度均勻，機械強度較好，且顯色最為明顯。綜合考慮，選擇旋涂速度為2000 r/min。

3.4.3 暴露時間的優(yōu)化 在MAF的質(zhì)量濃度為15%，旋涂速度為2000 r/min的條件下，控制MAF/PVC薄膜暴露在NH3濃度為76 mg/m3氛圍中的時間分別為3、4、5、6和7 min。隨著暴露時間延長，薄膜中的MAF與NH3發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生的DASAs增多，使得薄膜的顏色變化也隨之增大。當(dāng)暴露時間到達5 min時，薄膜的ΔE=17.22±0.19，繼續(xù)延長檢測時間，MAF/PVC薄膜的顏色變化不明顯。因此，本研究選擇暴露時間為5 min。

3.5 MAF/PVC薄膜對NH3的響應(yīng)曲線

圖5為在前驅(qū)液中MAF質(zhì)量濃度為15%、旋涂速度為2000 r/min的條件下制得的MAF/PVC薄膜暴露于38、76、114、152、190、228、266、304和342 mg/m3的NH3中5 min后的ΔE值。NH3濃度在38～266 mg/m3范圍內(nèi)與MAF/PVC薄膜ΔE值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔE=0.1478CNH3（mg/m3）- 2.9522 （R2=0.9911），MAF/PVC薄膜可以實現(xiàn)對38～266 mg/m3 NH3的定量檢測，對應(yīng)的MAF/PVC薄膜照片如圖5插圖所示，隨NH3濃度升高，薄膜顏色由淺黃色逐漸變成紅色，且薄膜各部分顯色均勻，驗證了MAF在薄膜中分布均勻且薄膜的厚度均一。此外，根據(jù)國際照明委員會（CIE）規(guī)定，當(dāng)ΔE>7時，可認為是人眼可分辨的顏色變化[22]。結(jié)合ΔE值和插圖中MAF/PVC薄膜的顯色照片，可以利用目視法直接評價76～266 mg/m3的NH3含量。

3.6 MAF/PVC薄膜的選擇性

為了考察MAF/PVC薄膜的選擇性，將薄膜分別暴露于甲胺、三甲胺、氨水、乙酸、乙醇和H2S的氣體環(huán)境中，響應(yīng)5 min得到薄膜ΔE值，如表1所示。只有當(dāng)MAF/PVC薄膜暴露在胺類氣氛中，其顏色才會發(fā)生顯著變化，表明此MAF/PVC薄膜具有良好的氣體選擇性，可用于揮發(fā)性胺的檢測。

3.7 MAF/PVC薄膜的穩(wěn)定性

考察了pH值及濕度對MAF/PVC薄膜的影響，將薄膜浸沒在pH 2.00～12.00的各緩沖溶液中5 min，顏色均未發(fā)生變化，表明MAF/PVC薄膜不受pH及濕度的影響。

為了考察MAF/PVC薄膜的性能穩(wěn)定性，將薄膜置于室溫儲存，每隔兩天進行一次NH3響應(yīng)實驗，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。由圖 6可見，在14 d內(nèi)，MAF/PVC薄膜的ΔE值幾乎不變，而在與NH3響應(yīng)后的各組ΔE值的相對標(biāo)準偏差為1.6%，表明在14 d內(nèi)薄膜能保持較好的顯色性能。

3.8 MAF/PVC薄膜在魚肉新鮮度檢測中的應(yīng)用

為了研究MAF/PVC薄膜在魚肉鮮度檢測中的應(yīng)用，將MAF/PVC薄膜固定在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)的頂部，樣品置于培養(yǎng)皿內(nèi)部，分別放置在25℃和4℃下貯藏，記錄薄膜的顏色變化，同時測定對應(yīng)樣品的TVB-N含量，結(jié)果如圖7所示。由圖7E和7F可見，貯藏在25℃和4℃的白鯽魚和鱸魚的TVB-N含量隨貯藏時間延長而呈增長趨勢。在貯藏初期（<24 h）增長緩慢，此時蛋白質(zhì)未大量分解，魚肉品質(zhì)較新鮮，MAF/PVC薄膜的ΔE值變化較小。當(dāng)貯藏時間超過24 h時，TVB-N的含量急劇上升，說明蛋白質(zhì)大量分解，魚肉的變質(zhì)速率加快，對應(yīng)的MAF/PVC薄膜顏色逐漸加深（圖7A～7D）。貯藏在25℃和4℃下的白鯽魚的TVB-N含量分別在36和80 h左右達到了國標(biāo)限定值[23]，此時白鯽魚不再新鮮，MAF/PVC薄膜對應(yīng)的ΔE=24.36。貯藏在25℃和4℃下的鱸魚的TVB-N含量分別在39和81 h達到了國標(biāo)限定值，ΔE=24.21。MAF/PVC薄膜的ΔE值與魚肉樣品中的TVB-N含量在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)，擬合曲線如圖8所示，線性回歸方程為C（TVB-N）=0.823ΔE+0.875（R2=0.996），表明MAF/PVC傳感膜在魚肉新鮮度檢測中具有良好的應(yīng)用潛力。

4 結(jié) 論

采用PVC薄膜包埋MAF分子，在MAF質(zhì)量濃度為15%、 旋涂速度為2000 r/min時，制得厚度均勻、表面平整的MAF/PVC薄膜。以MAF/PVC薄膜為NH3指示卡，可以實現(xiàn)對38～266 mg/m3 NH3的定量檢測， 同時對揮發(fā)性胺有較好的選擇性。將MAF/PVC薄膜應(yīng)用于監(jiān)測25℃和4℃貯藏條件下白鯽魚和鱸魚的新鮮度，魚肉新鮮時，MAF/PVC薄膜呈黃色; 魚肉腐敗變質(zhì)時，產(chǎn)生較多揮發(fā)性胺，MAF/PVC薄膜呈紫紅色。MAF/PVC薄膜色差值變化與魚肉的TVB-N含量變化具有良好的相關(guān)性，可用于魚肉新鮮度的評價。 MAF/PVC薄膜易制備，成本低，無需專業(yè)檢測設(shè)備，為現(xiàn)場快速檢測裝置的開發(fā)提供了理論依據(jù)，在其它高蛋白食品的新鮮度檢測中也有很好的應(yīng)用前景。

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