劉 蓉，滕文友，何章勇，代國(guó)知，郭旺源

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，湖南郴州 423001)

梅毒是梅毒螺旋體感染人體所引起的一種慢性、系統(tǒng)性、長(zhǎng)期發(fā)展的性傳播疾病，具有較強(qiáng)傳染性[1]。梅毒主要傳播途徑為性接觸傳播、母嬰垂直傳播和血液傳播。孕婦一旦感染，可導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)、死產(chǎn)或娩出先天梅毒患兒[2]。由于梅毒螺旋體培養(yǎng)困難，實(shí)驗(yàn)室常用血清學(xué)檢查進(jìn)行梅毒血清學(xué)篩查和診斷，包括梅毒螺旋體試驗(yàn)和非梅毒螺旋體試驗(yàn)[3]。梅毒螺旋體試驗(yàn)包括化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)(CLIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)、時(shí)間分辨熒光免疫試驗(yàn)(TRFIA)和膠體金法等。本研究擬以TPPA為確認(rèn)試驗(yàn)，比較TRFIA、ELISA和膠體金法檢測(cè)梅毒抗體不確定標(biāo)本的能力，為實(shí)驗(yàn)室選擇合適的梅毒檢測(cè)方法和策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 收集2019年10月15日至2020年1月17日于本院進(jìn)行梅毒特異性抗體檢測(cè)結(jié)果為不確定的血清標(biāo)本共142份，男54例，女88例，平均年齡(50±14)歲。

1.2標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn) 用TRFIA檢測(cè)梅毒血清抗體，1.0≤S/CO≤9.9為梅毒抗體不確定標(biāo)本，作為研究對(duì)象，納入研究。

1.3儀器與試劑 TPPA梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑盒(TPPA試劑)由日本富士瑞必歐株式會(huì)社生產(chǎn)，ELISA梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒(ELISA試劑)由北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，TRFIA梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑盒(TRFIA試劑)和EasyCuta MiNi全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)儀由江蘇蘇州新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，膠體金法梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑盒由廈門(mén)英科新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)，洗板機(jī)ELX-50和酶標(biāo)儀ELX-800由美國(guó)寶特公司生產(chǎn)。

1.4方法 將實(shí)驗(yàn)前收集并保存于-20 ℃的血清標(biāo)本取出并解凍，同時(shí)用TPPA、ELISA、TRFIA和膠體金法檢測(cè)。TPPA：加標(biāo)本稀釋液至U型反應(yīng)板，第1孔100 μL，第2～4孔各25 μL，用移液器取血清25 μL至第1孔，反復(fù)混勻后取25 μL至第2孔，連續(xù)倍比稀釋至第4孔，最后1孔混勻后棄去25 μL，第3孔加未致敏粒子25 μL，第4孔加致敏粒子25 μL，將微量反應(yīng)板置振蕩器振蕩30 s；置微量反應(yīng)板于有蓋濕盒內(nèi)，室溫靜置2 h后，觀(guān)察結(jié)果，第4孔凝集成實(shí)心圓為陰性，散在分布或者成環(huán)狀為陽(yáng)性。ELISA：分別在預(yù)包被板條孔中加入待測(cè)標(biāo)本100 μL，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照1孔、陰性對(duì)照各3孔和陽(yáng)性對(duì)照2孔；37 ℃溫育60 min；洗板5次；除空白對(duì)照孔外，分別加入酶標(biāo)記物100 μL，輕輕振蕩混勻；37 ℃溫育30 min；洗板5次；每孔加入顯色劑A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃顯色30 min；每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻；終止后10 min內(nèi)測(cè)試并輸出結(jié)果，結(jié)果判讀S/CO<1.0為陰性，S/CO≥1.0為陽(yáng)性。TRFIA：分別在相應(yīng)板條孔中加入待測(cè)標(biāo)本50 μL，同時(shí)設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照各2孔；各孔中加相應(yīng)銪標(biāo)抗原100 μL；室溫，振蕩45 min；洗板5次；各孔加入相應(yīng)銪標(biāo)生物素100 μL；室溫，振蕩15 min；洗板5次；每孔加入增強(qiáng)液各100 μL，室溫，振蕩15 min；加增強(qiáng)液后30 min內(nèi)自動(dòng)檢測(cè)并輸出結(jié)果，以S/CO<1.0為陰性，S/CO≥1.0為陽(yáng)性。膠體金法：從包裝袋內(nèi)取出試劑條，置于干凈平臺(tái)上，于加樣區(qū)加100 μL標(biāo)本，20 min內(nèi)讀取并記錄結(jié)果，僅出現(xiàn)質(zhì)控線(xiàn)為陰性，質(zhì)控線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)同時(shí)出現(xiàn)為陽(yáng)性。以上操作和結(jié)果判定均嚴(yán)格按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入EXCEL表格，用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。本研究數(shù)據(jù)為配對(duì)計(jì)數(shù)資料，以頻數(shù)或率表示。以TPPA為標(biāo)準(zhǔn)，采用受試者工作特征(ROC)曲線(xiàn)分析TRFIA、ELISA和膠體金法的檢測(cè)能力。

2 結(jié) 果

2.1TPPA、TRFIA、ELISA和膠體金法檢測(cè)結(jié)果分析 以TPPA結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，檢出梅毒抗體陽(yáng)性35例，陰性107例；TRFIA與TPPA不一致107例，均為假陽(yáng)性；ELISA與TPPA不一致8例，假陽(yáng)性和假陰性均為4例；膠體金法與TPPA不一致33例，假陽(yáng)性和假陰性分別為16例和17例。見(jiàn)表1。

表1 TRFIA、ELISA、膠體金法與TPPA檢測(cè)結(jié)果(n)

2.2TRFIA、ELISA和膠體金法檢測(cè)能力比較 以TPPA為標(biāo)準(zhǔn)，TRFIA的靈敏度為100.00%，而特異度為0.00%，假陽(yáng)性率高；ELISA靈敏度為88.57%，特異度為96.26%，符合率為94.37%；膠體金法靈敏度僅為51.43%，特異度和符合率分別為85.05%和76.76%，假陰性率高；ELISA陽(yáng)性似然比為23.68，TRFIA陰性似然比為0.00。見(jiàn)表2。

表2 TRFIA、ELISA和膠體金法檢測(cè)能力比較

2.3TRFIA、ELISA和膠體金法ROC曲線(xiàn) TRFIA、ELISA和膠體金法ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.50、0.92和0.68，其中ELISA檢測(cè)梅毒抗體不確定標(biāo)本準(zhǔn)確率最高，膠體金法次之，TRFIA最低。見(jiàn)圖1。

圖1 TRFIA、ELISA和膠體金法ROC曲線(xiàn)

3 討 論

目前，梅毒是一個(gè)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的公共性問(wèn)題。近年來(lái)，我國(guó)梅毒發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題[4]。在美國(guó)，梅毒流行率不斷上升，其中男性同性戀、育齡婦女和新生兒的梅毒發(fā)病率增幅最大[5]。

梅毒螺旋體篩查作為孕前優(yōu)生基本項(xiàng)目之一，其準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果是正確評(píng)價(jià)計(jì)劃懷孕夫婦患梅毒風(fēng)險(xiǎn)的重要依據(jù)[6]。我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行梅毒血清學(xué)篩查時(shí)，使用的方法種類(lèi)很多，在日常工作中使用不同檢測(cè)方法時(shí)，需充分了解其特點(diǎn)，報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)綜合分析，必要時(shí)可選擇多種方法進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[7]。

TPPA使用梅毒螺旋體毒株(Nichols株)制成抗原，與待測(cè)血清中的梅毒螺旋體抗體產(chǎn)生凝集反應(yīng)，其優(yōu)點(diǎn)是試劑穩(wěn)定、結(jié)果明了、靈敏度高和特異度高，缺點(diǎn)是手工操作繁瑣，結(jié)果需主觀(guān)判斷，對(duì)操作人員能力要求較高，試劑成本較高[1,8]，不易進(jìn)行大批量標(biāo)本檢測(cè)。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦使用TPPA來(lái)判定梅毒螺旋體試驗(yàn)和非梅毒螺旋體試驗(yàn)不一致的結(jié)果[9]，并將TPPA定為確診方法。因此，本研究將TPPA作為確認(rèn)試驗(yàn)，來(lái)評(píng)價(jià)其他3種方法對(duì)臨床常見(jiàn)梅毒抗體不確定標(biāo)本的檢測(cè)能力。

TRFIA是以鑭系元素(本研究試劑盒以銪元素為標(biāo)記)標(biāo)記抗原或抗體，與時(shí)間分辨測(cè)定技術(shù)結(jié)合而建立起來(lái)的一種新型非放射性微量分析方法，經(jīng)增強(qiáng)液放大，可以將檢測(cè)下限提高百萬(wàn)倍，具有靈敏度高、發(fā)光穩(wěn)定和熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于臨床檢測(cè)[10]。但在梅毒患病率較低的人群中，單獨(dú)使用靈敏度高、特異度較低的方法檢測(cè)，易導(dǎo)致誤診，會(huì)給患者造成不必要的傷害和情緒困擾[11-12]。由于TRFIA靈敏度高和特異度低，用于梅毒血清學(xué)篩查時(shí)，其檢測(cè)的低熒光強(qiáng)度的標(biāo)本需用TPPA進(jìn)一步確認(rèn)，以減少假陽(yáng)性。

ELISA因具有靈敏度高、特異度高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。本研究結(jié)果顯示，ELISA靈敏度、特異度和符合率均較高。膠體金法是常用的即時(shí)檢測(cè)方法，快速、簡(jiǎn)便，但由于靈敏度低，使其應(yīng)用受到限制。有學(xué)者認(rèn)為單獨(dú)采用ELISA檢測(cè)出的假陽(yáng)性結(jié)果，在沒(méi)有“金標(biāo)準(zhǔn)”做補(bǔ)充的情況下，很難作出明確的判斷。血清學(xué)結(jié)果不一致的患者[如EIA-反應(yīng)性、快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR)-無(wú)反應(yīng)性]對(duì)臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)是診斷和治療的挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@些結(jié)果可能是假陽(yáng)性、梅毒前期或在反應(yīng)性RPR發(fā)生前的早期梅毒[13-14]。因此，血清學(xué)結(jié)果不一致時(shí)需用TPPA確認(rèn)。但這樣可能會(huì)帶來(lái)一些不必要且重復(fù)的工作，增加實(shí)驗(yàn)室的試劑和人力成本，這就需要實(shí)驗(yàn)室制訂科學(xué)合理的梅毒檢測(cè)策略和復(fù)檢規(guī)則，以便精簡(jiǎn)工作流程，提高工作效率和結(jié)果準(zhǔn)確性。

既往有關(guān)于CLIA與ELISA和膠體金法等梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法比較和評(píng)價(jià)的研究[15]，而對(duì)于梅毒螺旋體抗體不確定標(biāo)本的檢測(cè)歷來(lái)備受關(guān)注但研究不多。本研究創(chuàng)新地比較了TRFIA、ELISA和膠體金法在梅毒螺旋體抗體不確定標(biāo)本的檢測(cè)能力。首先，隨著TRFIA技術(shù)的成熟，其被廣泛應(yīng)用，需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果供參考和選擇。其次，筆者在前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TRFIA的S/CO>9.3時(shí)，TRFIA與TPPA結(jié)果一致，因此，本研究選擇1.0≤S/CO≤9.9的標(biāo)本作為梅毒抗體不確定標(biāo)本進(jìn)行研究。此外，不論是梅毒血清學(xué)篩查，還是確認(rèn)試驗(yàn)，梅毒抗體不確定標(biāo)本才是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的難點(diǎn)和重點(diǎn)，只有此類(lèi)標(biāo)本結(jié)果的準(zhǔn)確性才能真實(shí)和客觀(guān)地評(píng)價(jià)某種檢測(cè)方法和診斷試劑。

本研究的不足之處在于，僅選擇了1.0≤S/CO≤9.9的梅毒抗體不確定標(biāo)本進(jìn)行研究，若能同時(shí)選擇S/CO>9.9和S/CO<1.0的標(biāo)本，將能更加全面地比較和評(píng)價(jià)3種方法的檢測(cè)能力，計(jì)劃下一步開(kāi)展此研究。

本研究結(jié)果顯示，TRFIA雖靈敏度高，但特異度低，若用于梅毒血清學(xué)篩查，低熒光強(qiáng)度的標(biāo)本需加做TPPA，以減少誤診；ELISA的靈敏度、特異度和符合率均高，可用于實(shí)驗(yàn)室梅毒血清學(xué)篩查和診斷，但灰區(qū)標(biāo)本仍需TPPA確認(rèn)；膠體金法靈敏度低，易漏診，不宜用于梅毒血清學(xué)篩查，但在無(wú)條件開(kāi)展其他梅毒血清學(xué)檢測(cè)的基層或者社區(qū)實(shí)驗(yàn)室和僻遠(yuǎn)地區(qū)及術(shù)前急查時(shí)也是可以選擇的。因此，建議實(shí)驗(yàn)室應(yīng)全面了解各種梅毒檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)和性能，并結(jié)合自身?xiàng)l件和被檢測(cè)人群的梅毒流行病學(xué)特征，選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法和策略，以減少誤診和漏診，提高梅毒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以便更好地服務(wù)臨床和患者。

綜上所述，TRFIA靈敏度高，可用于梅毒血清學(xué)篩查；ELISA的靈敏度、特異度和符合率均高，可用于梅毒血清學(xué)篩查和診斷；膠體金法的靈敏度低，不宜用于梅毒血清學(xué)篩查。檢測(cè)灰區(qū)的梅毒抗體不確定標(biāo)本需用TPPA復(fù)查，以減少誤診。