羅業(yè)姣，龔仁國，陳 齊，張 靜，王君蓮

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科,四川成都 610500)

慢性牙周炎是口腔科的常見疾病，表現(xiàn)為牙周組織慢性炎癥性破壞，嚴(yán)重危害口腔健康，同時(shí)也是導(dǎo)致成年人牙缺失的主要原因之一。牙菌斑被認(rèn)為與慢性牙周炎的發(fā)病密切相關(guān)，其可引起牙周組織炎性反應(yīng)激活[1-2]，但牙菌斑激活炎性反應(yīng)的機(jī)制仍不明確。近年來，微小RNA(miR)在多種炎癥性疾病中的作用受到了越來越多的關(guān)注[3-4]，其中miR-146a已經(jīng)被證實(shí)在慢性牙周炎患者的唾液中存在異常表達(dá)，并且與多項(xiàng)牙周指標(biāo)、炎性細(xì)胞因子均存在相關(guān)性[5]；miR-21則被證實(shí)在侵襲性牙周炎中存在異常表達(dá)[6]，但國內(nèi)關(guān)于miR-21在慢性牙周炎中的變化及意義鮮見報(bào)道。為此，本研究擬分析慢性牙周炎唾液中miR-21水平與牙周指標(biāo)、炎性細(xì)胞因子及蛋白酶相關(guān)分子水平的相關(guān)性，旨在闡明miR-21在慢性牙周炎發(fā)生及病情發(fā)展中的作用，進(jìn)而為將來探究慢性牙周炎發(fā)病機(jī)制，尋找慢性牙周炎新的診療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年3月至2019年3月本院收治的50例慢性牙周炎患者作為慢性牙周炎組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床判斷為慢性牙周炎且至少一顆牙探診深度超過5 mm；(2)首次診斷，入組前未接受過牙周治療；(3)臨床資料及唾液標(biāo)本完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并慢性咽炎、扁桃體炎等口腔局部炎癥；(2)近3個(gè)月接受過抗菌藥物、免疫抑制劑治療；(3)合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、糖尿病。選擇同期體檢的50例健康志愿者作為健康對(duì)照組。慢性牙周炎組中男29例，女21例；年齡34～59歲，平均(44.58±8.12)歲。健康對(duì)照組中男27例，女23例；年齡33～60歲，平均(46.17±9.67)歲。兩組間一般資料的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究取得研究對(duì)象的知情同意及本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號(hào)為倫審(H20151223)。

1.2儀器與試劑 miRNA提取試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司，白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-17、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-8、MMP組織抑制物-1(TIMP-1)的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自上海西唐公司。

1.3方法

1.3.1唾液標(biāo)本的收集 慢性牙周炎組在治療前進(jìn)行標(biāo)本收集，健康對(duì)照組在體檢時(shí)進(jìn)行標(biāo)本收集，晨起后用蘸有2%枸櫞酸的棉簽擦拭口腔，然后用1.5 mL的EP管收集唾液約1 mL，在4 ℃離心機(jī)中3 000 r/min離心15 min，取唾液上清并分為兩份，放置在-80 ℃保存。

1.3.2唾液中miR-21表達(dá)水平的檢測 取一份唾液標(biāo)本，采用miRNA提取試劑盒提取標(biāo)本中的miRNA，采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒對(duì)cDNA中的miR-21及U6進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，miR-21的上游引物序列為5′-TAGCTAGCGTAGCTAGCT-3′，下游引物為試劑盒通用引物；U6的上游引物序列為5′-GCATGTAGCTAGCTAGCTAA-3′， 下游引物序列為5′-TGCTAGCTTAGCTAGAACTG-3′。PCR程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min后95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完成后在軟件中自動(dòng)生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以U6為內(nèi)參、計(jì)算miR-21的表達(dá)量，用2-ΔCt法計(jì)算，ΔCt=CtmiR-21-CtU6。

1.3.3唾液中炎性細(xì)胞因子及蛋白酶相關(guān)分子的檢測 取另一份唾液標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-1、MMP-8、TIMP-1的水平，均按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4牙周指標(biāo)的檢測 由主治醫(yī)師級(jí)別以上的醫(yī)生進(jìn)行牙周指標(biāo)的檢測，具體指標(biāo)包括菌斑指數(shù)(PLI)、牙齦指數(shù)(GI)、牙周探診深度(PD)、附著喪失(AL)。

2 結(jié) 果

2.1慢性牙周炎組與健康對(duì)照組唾液中miR-21表達(dá)水平比較 健康對(duì)照組唾液中miR-21的表達(dá)水平為0.95±0.18，慢性牙周炎組唾液中miR-21的表達(dá)水平為2.11±0.52；與健康對(duì)照組比較，慢性牙周炎組唾液中miR-21的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.906，P<0.001)。

2.2慢性牙周炎組與健康對(duì)照組牙周指標(biāo)比較 與健康對(duì)照組比較，慢性牙周炎組的PLI、GI、PD、AL均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 慢性牙周炎組與健康對(duì)照組牙周指標(biāo)比較

2.3慢性牙周炎組與健康對(duì)照組唾液中炎性細(xì)胞因子水平比較 與健康對(duì)照組比較，慢性牙周炎組唾液中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 慢性牙周炎組與健康對(duì)照組唾液中炎性細(xì)胞因子水平比較

2.4慢性牙周炎組與健康對(duì)照組唾液中蛋白酶相關(guān)分子水平比較 與健康對(duì)照組比較，慢性牙周炎組唾液中MMP-1、MMP-8、TIMP-1水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 慢性牙周炎組與健康對(duì)照組唾液中蛋白酶相關(guān)分子水平比較

2.5慢性牙周炎患者唾液中miR-21水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性 慢性牙周炎患者唾液中miR-21水平與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-1、MMP-8、TIMP-1、PLI、GI、PD、AL呈正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 慢性牙周炎患者唾液中miR-21水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性(n=50)

3 討 論

慢性牙周炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多因素及多環(huán)節(jié)，牙周組織在牙菌斑作用下出現(xiàn)炎性反應(yīng)的過度激活是其基本的病理變化，闡明在牙菌斑促進(jìn)炎性反應(yīng)激活過程中的關(guān)鍵分子有助于深入認(rèn)識(shí)慢性牙周炎的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而也為探尋新的診療靶點(diǎn)提供依據(jù)[7]。miR是近年來口腔科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，miR本身不具備編碼氨基酸的功能，需要通過與靶基因mRNA結(jié)合來改變靶基因表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)作用。miR-21是一類參與炎性反應(yīng)調(diào)控的miR，但目前關(guān)于miR-21在炎性反應(yīng)中的具體調(diào)控作用尚無定論。有研究認(rèn)為，miR-21通過靶向JNK及TSG4發(fā)揮抑炎作用[8-9]；另有研究認(rèn)為，miR-21通過上調(diào)NLRP3及IL-8的表達(dá)發(fā)揮促炎作用[10-11]。

吳麗娜等[6]以侵襲性牙周炎患者為對(duì)象的研究結(jié)果顯示，侵襲性牙周炎患者的齦溝液中miR-21表達(dá)水平明顯升高，且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，慢性牙周炎患者唾液中miR-21的表達(dá)水平明顯升高，提示miR-21表達(dá)水平升高與慢性牙周炎的病情加重有關(guān)。進(jìn)一步通過牙周指標(biāo)的檢查來評(píng)價(jià)慢性牙周炎的病情，發(fā)現(xiàn)PLI、GI、PD、AL 4項(xiàng)指標(biāo)均發(fā)生了明顯變化，且miR-21的表達(dá)水平與4項(xiàng)牙周指標(biāo)均呈正相關(guān)，提示miR-21可能在一定程度上影響了慢性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展，發(fā)生這一變化可能與miR-21促進(jìn)炎性反應(yīng)激活有關(guān)，也可能與miR-21抑制炎性反應(yīng)，并在牙周炎發(fā)生、發(fā)展過程中代償性表達(dá)增多有關(guān)，但miR-21在慢性牙周炎中起到促炎作用還是抑炎作用，仍需后續(xù)細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

牙周組織在牙菌斑刺激下發(fā)生炎性反應(yīng)的激活是慢性牙周炎基本的病理改變，IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α等多種炎性細(xì)胞因子在牙周組織炎性反應(yīng)激活的過程中被大量釋放。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，牙周炎患者齦溝液中上述幾種炎性細(xì)胞因子的水平明顯升高[12-14]，本研究的分析結(jié)果與既往研究結(jié)果一致。進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者唾液中miR-21的表達(dá)水平與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α的水平呈正相關(guān)，說明miR-21表達(dá)水平升高可能與炎性細(xì)胞因子的釋放、炎性反應(yīng)的激活有關(guān)。牙周組織中炎性反應(yīng)的激活能夠使多種炎癥細(xì)胞在局部浸潤，進(jìn)而釋放MMP-1、MMP-8、TIMP-1等蛋白酶及抑制分子并介導(dǎo)牙周組織的水解和破壞[15-17]。本研究結(jié)果顯示，慢性牙周炎組唾液中MMP-1、MMP-8、TIMP-1的水平升高且與miR-21呈正相關(guān)，說明miR-21表達(dá)水平升高可能與慢性牙周炎病程中蛋白酶介導(dǎo)的牙周組織破壞有關(guān)。

4 結(jié) 論

慢性牙周炎患者唾液中miR-21表達(dá)水平異常升高，且與牙周指標(biāo)、炎性細(xì)胞因子及蛋白酶分子水平均有一定相關(guān)性，提示其可能在慢性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了一定作用。但是，miR-21在慢性牙周炎中具體發(fā)揮促炎還是抑炎的作用有待進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。