賴斯華，黃歡歡，謝閨娥，曾文創(chuàng)，楊 羚，徐 霞△

(1.廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院，廣東廣州 510030;廣州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院:2.呼吸疾病國家重點實驗室;3.檢驗科,廣東廣州 510030)

近年來，我國所面臨的革蘭陰性桿菌耐藥問題尤為嚴峻，包括產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)腸桿菌科細菌、耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌等[1]。其中，為治療耐碳青霉烯類腸桿菌，多黏菌素重新進入臨床使用，其成為治療耐碳青霉烯類菌株的“最后一道防線”。過去認為，黏菌素的耐藥是由染色體相關(guān)基因突變引起的，其耐藥性不能在細菌間傳播。然而，2015年中國學者LIU等[2]首次發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒攜帶黏菌素耐藥基因mcr1，證實了黏菌素的耐藥性也可以通過質(zhì)粒在不同菌屬間進行水平傳播，治療耐碳青霉烯類菌株的最后一道防線被打破，給臨床治療感染提出了巨大的挑戰(zhàn)。

從mcr1基因開始被報道至2019年4月，共發(fā)現(xiàn)了7種mcr1的變異體，分別為mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8[3]。目前，mcr亞型基因在腸道菌群中和在耐碳青霉烯菌株中的流行率尚不明確。本研究通過篩查住院患者和體檢人群的糞便標本中耐黏菌素菌株中mcr亞型基因的攜帶情況，以及臨床分離標本中耐碳青霉烯菌株中mcr亞型基因的攜帶情況，比較不同標本中mcr亞型基因的流行情況，并探究攜帶mcr基因的菌株與黏菌素及碳青霉烯類藥物的耐藥表型之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1菌株來源 糞便菌株為2017年6-10月廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院的住院患者1 263份糞便標本分離的92株耐黏菌素菌株及廣州金域體檢中心體檢的750份糞便標本分離的36株耐黏菌素菌株(黏菌素耐藥：≥2 mg/L)，同時保存患者的臨床資料(包括性別、年齡、就診科室、病史)。臨床分離菌株為廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科微生物室2017年1月至2018年7月的痰、尿液、分泌物等臨床標本。對每一份標本同時進行3種碳青霉烯類藥物的藥敏實驗，收集和保存厄他培南(耐藥:≥2 mg/L)、亞胺培南(耐藥:≥4 mg/L)和美羅培南 (耐藥:≤19 mm)其中一種或以上碳青霉烯類藥物耐藥的菌株，共得到130株耐碳青霉烯菌株，收集菌株的同時記錄患者臨床資料(科室、年齡、性別、分離日期等)。大腸埃希菌J53由廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科惠贈。

1.2儀器與試劑 LB肉湯干粉、麥康凱瓊脂粉、營養(yǎng)瓊脂購自廣州環(huán)凱微生物公司；PCR及電泳相關(guān)制品購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；電泳瓊脂糖購自法國Biowest公司；所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR儀購自美國Bio-Rad公司；G:BOX凝膠成像系統(tǒng)購自英國Syngene公司。

1.3方法

1.3.1細菌基因組DNA提取 挑取單菌落用5 mL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，180 r/min，37 ℃搖菌6 h。參照QIAamp DNA 小提試劑盒使用說明書提取細菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2耐藥基因篩查 用PCR法對138株耐黏菌素的糞便分離菌株和130株耐碳青霉烯的臨床分離菌株進行mcr基因(mcr1、mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8)的特異性引物篩查，具體的引物參考國外相關(guān)文獻[3-5]合成，見表1。特異性篩查mcr1為陽性的菌株用全長序列(1 626 bp)的擴增引物MCR-F(5′-ATGATGCAGCATACTTCTGTGT-3′)及MCR-R(5′-TCAGCGGATGAATGCG-3′)進行擴增，將產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序，并進行BLAST比對證實擴增產(chǎn)物基因的正確性。此外，對含mcr基因的陽性菌株進行11種碳青霉烯酶基因擴增(blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaKPC、blaNDM、blaBIC、blaOXA-48、blaAIM、blaDIM、blaGIM和blaSIM)[6]，確定碳青霉烯酶基因是否存在。

表1 8種mcr基因的特異性篩查引物

1.3.3菌株鑒定及藥物敏感試驗 按照質(zhì)譜儀及法國生物梅里埃VITEK-2藥敏分析系統(tǒng)操作說明書進行細菌鑒定和藥敏分析。抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)試驗用微量肉湯稀釋法，結(jié)果參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI) M100-S26標準判讀，黏菌素的藥敏折點參照EUCAST7.0版判讀標準(敏感:≤2 mg/L)。

1.3.4質(zhì)粒接合實驗 用mcr1基因陽性菌株作為供體菌，大腸埃希菌J53作為受體菌，接合前進行供受體菌的抗性驗證。能在雙抗培養(yǎng)基(含2 mg/L黏菌素及150 mg/L疊氮鈉)生長的為接合子，挑取單個菌落在雙抗培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3代，獲得穩(wěn)定傳代的接合子。用PCR法驗證接合子中mcr1基因的存在。

1.3.5質(zhì)粒復制子分型 用基于PCR的質(zhì)粒復制子分型法對腸桿菌科細菌中18個主要質(zhì)粒家族復制子(HI1、HI2、I1/Iγ、X、L/M、N、FIA、FIB、W、Y、P、T、FIC、A/C、FIIs、K、B/O、F)[7]進行檢測，并增加對IncX1-IncX4[8]的檢測。用以上質(zhì)粒復制子引物對mcr1基因陽性菌株進行PCR擴增，產(chǎn)物測序后比對得出相應的復制子類型。

1.3.6毒力基因檢測 用特異性PCR法，對mcr1陽性大腸埃希菌進行12種毒力因子的檢測(stx1、stx2、eae、hlyA[9],fyuA、iutA、sfa/foc、ibeA、fimH、cnf-1、papC和 kpsMTⅡ[10])。

2 結(jié) 果

2.1耐藥基因篩查 128株耐黏菌素的糞便標本分離株中(92株來自住院患者和36株來自體檢人群)篩查mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8共7種mcr亞型基因，均未發(fā)現(xiàn)陽性基因。

130株耐碳青霉烯菌株篩查mcr1、mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8共8種mcr亞型基因，發(fā)現(xiàn)1株mcr1陽性菌株——A57號菌株。經(jīng)mcr1全長序列擴增并BLAST比對后，相似性為100%，確證A57號攜帶mcr1陽性基因，PCR結(jié)果見圖1。對mcr1陽性的菌株A57進行11種碳青霉烯酶基因擴增，未發(fā)現(xiàn)碳青霉烯酶陽性基因。

注：A為mcr1基因502 bp特異性片段擴增電泳圖；B為mcr1基因全長序列1 626 bp擴增電泳圖。圖1 PCR擴增電泳圖

2.2mcr陽性菌株鑒定及藥物敏感試驗 A57號菌株經(jīng)質(zhì)譜鑒定為大腸埃希菌。如表2所示，其藥敏結(jié)果顯示對黏菌素的MIC為2 mg/L，判讀為中介，ESBLs檢測陽性，并對19種藥物表現(xiàn)出耐藥差異性，對頭孢類、青霉素類、喹諾酮及磺胺類藥物等12種藥物表現(xiàn)出耐藥性(58%，11/19)，其中對一、二、三、四代頭孢類藥物表現(xiàn)出耐藥性(88%，8/9)。

表2 攜帶mcr1基因的大腸埃希菌藥物敏感試驗結(jié)果

2.3質(zhì)粒接合 mcr1基因陽性的菌株質(zhì)粒接合成功，獲得穩(wěn)定傳代的接合子，PCR驗證接合子中含有mcr1基因，即mcr1基因存在于質(zhì)粒上，并能通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。

2.4質(zhì)粒復制子分型與毒力基因檢測 mcr1基因陽性菌株攜帶6種質(zhì)粒，分別為IncFIB、IncFIC、IncA/C、IncI1、IncFrepB、IncX4。mcr1基因陽性菌株攜帶3種毒力基因，分別為編碼Ⅰ型菌毛黏附素的基因fimH、與鐵攝取相關(guān)的氣桿菌素受體的基因iutA、與莢膜形成相關(guān)的基因kpsMTⅡ。

3 討 論

mcr1基因的發(fā)現(xiàn)證實黏菌素的耐藥性可通過質(zhì)粒在不同種屬的細菌間進行水平傳播，黏菌素耐藥率可迅速提高，因此，自2015年來，國際上掀起了研究mcr基因的熱潮。在很短的時間內(nèi)，mcr1基因已經(jīng)在6個大洲(除南極洲)的18個國家中被發(fā)現(xiàn)。迄今為止，除了mcr1以外，關(guān)于mcr2～mcr8基因在人類樣本中流行情況的數(shù)據(jù)較少。中國香港一家醫(yī)院收集2016年的672份糞便標本，檢測出14株mcr1基因陽性大腸埃希菌[11]。蘇州一家醫(yī)院收集了134例接受不孕不育評估女性的陰道拭子標本，其中mcr4基因檢出率為12.7%，mcr3和mcr2基因檢出率均為15.0%，mcr1和mcr5基因檢出率為0.7%[12]。在另外一項國內(nèi)的研究中發(fā)現(xiàn)，mcr3基因在豬和農(nóng)民中的檢出率為0.75%，分布于13個省，廣東省發(fā)現(xiàn)2例農(nóng)民攜帶mcr3基因[13]。8種mcr亞型基因在人類身上的流行率尚十分不明確，本研究選取了mcr1流行率高的腸道細菌來探究mcr亞型基因的流行情況。

在收集的耐黏菌素菌株中，前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3株mcr1基因陽性菌株[14]。本研究在128份耐黏菌素糞便標本中均沒有檢出mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8這7種亞型基因，說明除mcr1基因外，其余mcr亞型基因在腸道菌群中流行率非常低。在耐碳青霉烯類藥物的130份臨床感染標本中，發(fā)現(xiàn)1例由痰標本分離得到的mcr1基因陽性的大腸埃希菌菌株A57號(0.76%)，但沒有檢出其余7種mcr亞型基因，說明耐碳青霉烯菌株中mcr的流行率不高。在我國的臨床標本中還是以mcr1基因為主，其次為mcr2、mcr3和mcr4，mcr5、mcr6和mcr7比較少見，但由于旅游人員及動物的流通，仍需動態(tài)觀察我國mcr亞型基因的流行情況，以防m(xù)cr的大規(guī)模流行，使治療陷入無藥可用的局面。

黏菌素被認為是用于治療耐碳青霉烯菌株的有效藥物,mcr1基因與碳青霉烯耐藥基因同時存在,這成為全球的一大關(guān)注點。本研究中，mcr1基因陽性的大腸埃希菌盡管沒有篩查到碳青霉烯酶基因，但該菌株對碳青霉烯類藥物耐藥的同時也對黏菌素耐藥，這使臨床上可選擇的治療藥物大大減少。本研究中mcr1基因陽性的大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs,該菌株幾乎對所有的頭孢類藥物耐藥：對一、二代頭孢類藥物均耐藥，三代頭孢類藥物中只對頭孢哌酮敏感。IncX4、IncI1型質(zhì)粒為常見的質(zhì)粒型傳播mcr1基因。質(zhì)粒接合實驗證實mcr1基因可以通過水平方式轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌J53中，說明mcr1基因在腸桿菌科細菌之間存在潛在傳播的風險。WANG等[15]從養(yǎng)雞場、農(nóng)場、廢水、蒼蠅、屠宰場和超市中分離的細菌中檢測到mcr1 基因，這說明mcr1基因已經(jīng)廣泛存在于人類生活的環(huán)境中，成為細菌感染治療中的巨大隱患。

4 結(jié) 論

本文探究了mcr亞型基因在廣東地區(qū)的不同標本中的流行率，其中mcr1在腸道細菌中檢出率較高。盡管目前mcr亞型基因的流行率尚低，但其爆發(fā)將會造成嚴重后果，仍需從人類、動物和環(huán)境3個方面持續(xù)監(jiān)測mcr亞型基因的流行率，及時有效地防控mcr亞型基因的擴散。