孔 昊,張 強(qiáng),張 薇,劉偉文,曹成喜*,樊柳蔭

(1.上海交通大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新中心,上海 200240;2.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200240;3.上海交通大學(xué)電子信息與電氣工程學(xué)院,上海 200240)

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是一種重要的工具酶,被廣泛用于開(kāi)發(fā)基于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[1]、酶聯(lián)適配體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)[2]以及其他基于酶催化反應(yīng)[3]的生化檢測(cè)方法。同時(shí),納米酶[4]、核酸過(guò)氧化物模擬酶[5]等具有HRP催化活性的物質(zhì)亦被廣泛地用于開(kāi)發(fā)生化分析方法。因此,開(kāi)發(fā)檢測(cè)HRP的方法具有非常重要的意義。目前,HRP檢測(cè)方法主要基于光學(xué)檢測(cè)[1-5]以及電化學(xué)檢測(cè)[6-8]等方法進(jìn)行檢測(cè)。這些方法依賴(lài)于昂貴、精密的儀器實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè),對(duì)于實(shí)驗(yàn)環(huán)境、檢測(cè)成本有著較高要求,難以用于即時(shí)檢測(cè),不易在條件受限地區(qū)推廣應(yīng)用。

電泳滴定(electrophoresis titration,ET)是一種基于移動(dòng)反應(yīng)界面原理的可視化檢測(cè)方法,最初被用來(lái)對(duì)食品中蛋白質(zhì)總量進(jìn)行特異性檢測(cè)[9,10]。近年來(lái),隨著檢測(cè)模型以及芯片技術(shù)的開(kāi)發(fā),電泳滴定擺脫了傳統(tǒng)電泳裝置,實(shí)現(xiàn)了芯片化,并已成功用于乳制品中三聚氰胺及尿液中疾病標(biāo)志物的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[11,12]。本文在上述研究基礎(chǔ)上,對(duì)隱色結(jié)晶紫(LCV)顯色體系與3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色體系在HRP催化顯色過(guò)程中的顯色效率進(jìn)行了比較,以TMB顯色體系建立了基于氧化還原反應(yīng)界面移動(dòng)距離的可視化定量測(cè)定HRP的方法。該方法直觀、簡(jiǎn)單、操作成本低,不需要光學(xué)檢測(cè)設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)HRP的裸眼檢測(cè),對(duì)于具有HRP活性的物質(zhì)進(jìn)行酶活測(cè)定或基于酶反應(yīng)的生物標(biāo)志物的檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1儀器

PE&ENSPIRE 2300酶標(biāo)儀(珀金埃爾默,美國(guó))。

電泳滴定檢測(cè)芯片由聚甲基丙烯酸甲酯材料加工,結(jié)構(gòu)如圖1所示,由陽(yáng)極池(φ6 mm×5 mm)、橋接通道(5 mm×0.5 mm×0.5 mm)、樣品池(φ6 mm×5 mm)、滴定通道(10 mm×0.5 mm×0.5 mm)、陰極池(φ6 mm×5 mm)組成。將顯色液加入樣品池中進(jìn)行電泳滴定檢測(cè)。電源由36 V鋰電池組提供。

圖1 電泳滴定芯片結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of electrophoresis titration (ET)chip 1.anode well;2.bridge channel;3.sample well;4.titration channel;5.cathode well.

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

HRP(RZ(Reinheit Zahl)>3.0,>300 units/mg,麥克林,中國(guó));EL-TMB顯色試劑盒(生工生物工程,中國(guó));西班牙瓊脂糖(agarose G-10,Biowest,法國(guó));氯化鉀(KCl,純度99.5%)、過(guò)氧化氫溶液(H2O2,質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)、甲醇(CH3OH,純度≥99.5%)、LCV(純度98%)、氫氧化鈉(NaOH,純度96%)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB·2HCl,純度98%)(麥克林,中國(guó));鹽酸(HCl,質(zhì)量分?jǐn)?shù)36.0%～38.0%);L-抗壞血酸(L-ascorbic acid,AA,純度≥99.7%)(國(guó)藥,中國(guó))。

1.1.3溶液配制

LCV溶液:稱(chēng)量0.018 7 g LCV固體,用甲醇溶解并定容至50 mL,得到濃度為1 mmol/L的LCV溶液。

TMB·2HCl溶液:稱(chēng)量0.094 0 g TMB·2HCl固體,用超純水溶解并定容至10 mL,得到濃度為30 mmol/L的TMB·2HCl溶液。

LCV顯色液:組分為1.67 mmol/L KCl、0.167 mmol/L H2O2和0.25 mmol/L LCV。

TMB顯色液:組分為1.67 mmol/L KCl、0.167 mmol/L H2O2和0.25 mmol/L TMB·2HCl。

EL-TMB顯色液:按照EL-TMB試劑盒說(shuō)明書(shū)配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

1.2.1LCV顯色體系電泳滴定檢測(cè)原理

基于LCV的HRP催化顯色體系常被用來(lái)對(duì)過(guò)氧化氫進(jìn)行檢測(cè)。HRP能夠催化H2O2分解并進(jìn)一步氧化無(wú)色LCV,生成藍(lán)紫色帶正電荷的結(jié)晶紫離子(CV+):

(1)

體系中HRP濃度越高,一定時(shí)間內(nèi)反應(yīng)生成CV+的速度越快。在滴定通道中,CV+與凝膠中的OH-發(fā)生反應(yīng),生成無(wú)色、不帶電荷的CV-OH伯醇分子(見(jiàn)圖2a):

(2)

通道中OH-濃度一定時(shí),界面遷移速度由CV+濃度決定,故可通過(guò)對(duì)界面遷移距離進(jìn)行測(cè)定,實(shí)現(xiàn)HRP定量檢測(cè)。

1.2.2TMB顯色體系電泳滴定檢測(cè)原理

基于TMB的HRP催化顯色體系被廣泛應(yīng)用于基于HRP的生化檢測(cè)之中[1,2,4]。HRP能夠催化H2O2分解并進(jìn)一步氧化無(wú)色TMB,生成藍(lán)色帶正電荷的TMB陽(yáng)離子(TMB·+):

(3)

體系中HRP濃度越高,一定時(shí)間內(nèi)反應(yīng)生成TMB·+的速度越快。由于TMB·+在酸性或堿性條件下會(huì)生成顏色以及電荷性質(zhì)不同的衍生產(chǎn)物、對(duì)檢測(cè)以及結(jié)果判斷帶來(lái)干擾,用OH-對(duì)其進(jìn)行滴定時(shí)難以判斷界面位置,故采用氧化還原反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行電泳滴定。在滴定通道中,TMB·+與凝膠中的AA發(fā)生氧化還原反應(yīng),被還原為無(wú)色的TMB[13](見(jiàn)圖2b):

(4)

圖2 基于(a)LCV顯色體系和(b)TMB顯色體系的電泳滴定模型Fig.2 ET models based on (a)leucocrystal violet (LCV)chromogenic system and (b)3,3′,5,5′-tetramethyl-benzidine (TMB)chromogenic system CV+:crystal violet cation;CV-OH:crystal violet carbinol;TMB·+:3,3′,5,5′-tetramethyl benzidine radical cation;TMB:3,3′,5,5′-tetramethyl benzidine;AA:L-ascorbic acid;AA·-:L-ascorbic acid radical anion.The symbols “+” and “-” indicate anode and cathode,respectively.

產(chǎn)物AA·-不與TMB或TMB·+發(fā)生反應(yīng)。通道中AA濃度一定時(shí),界面遷移速度由TMB·+濃度決定,故可通過(guò)對(duì)界面遷移距離進(jìn)行測(cè)定,實(shí)現(xiàn)HRP定量檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1顯色體系顯色效率比較步驟

分別在100 μL LCV顯色液、TMB顯色液和EL-TMB顯色液中加入10 μL不同濃度的HRP溶液,常溫避光反應(yīng)4 min,用酶標(biāo)儀讀取590 nm(LCV顯色液)與652 nm(TMB顯色液與EL-TMB顯色液)的吸光度數(shù)值。

1.3.2TMB顯色體系電泳滴定檢測(cè)HRP實(shí)驗(yàn)條件和步驟

在100 μL EL-TMB顯色液中加入不同濃度HRP,25 ℃下催化顯色5 min,并對(duì)顯色液進(jìn)行4 min電泳滴定檢測(cè)。滴定通道凝膠:40 mmol/L KCl、0.1 mmol/L AA和1%(1 g/100 mL,下同)瓊脂糖凝膠。橋接通道凝膠:40 mmol/L KCl和1%瓊脂糖凝膠。陽(yáng)極液:40 mmol/L NaOH。陰極液:40 mmol/L HCl和0.1 mmol/L AA。滴定電壓:36 V。每隔30 s記錄界面遷移距離,計(jì)算界面遷移速度。

2 結(jié)果與討論

2.1 LCV與TMB顯色體系顯色效率的對(duì)比

首先,比較了LCV顯色液、TMB顯色液與EL-TMB顯色液在HRP催化條件下的顯色效率差異。LCV顯色液的顯色產(chǎn)物為CV+(λmax≈590 nm),而TMB與EL-TMB顯色液的顯色產(chǎn)物為T(mén)MB·+(λmax≈652 nm)。結(jié)果如圖3所示,在相同的反應(yīng)條件下,TMB顯色液在顯色效率上相較于LCV顯色液約有兩個(gè)數(shù)量級(jí)的優(yōu)勢(shì)。同時(shí),相較于TMB顯色液,反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化的EL-TMB顯色液有著更高的顯色效率。兩種顯色體系在顯色效率上的差異主要可歸結(jié)于以下原因:首先,針對(duì)不同的顯色反應(yīng)底物,HRP有著不同的催化顯色效率,作為常用的HRP顯色底物之一,TMB相較于LCV有著更高的催化顯色效率；其次,LCV難溶于水而在甲醇中溶解度較高,甲醇等溶劑將影響HRP催化效率[14],從而影響檢測(cè)靈敏度；同時(shí),用LCV溶液配制顯色液時(shí),可觀察到LCV從溶液中析出(見(jiàn)圖3中LCV顯色體系較高的吸光度背景信號(hào)),這導(dǎo)致HRP催化LCV顯色液時(shí),溶液中LCV的實(shí)際濃度低于理論濃度。上述因素共同作用導(dǎo)致了兩種顯色體系在顯色效率上的差異?；谄湓陲@色效率的優(yōu)勢(shì),本試驗(yàn)選擇EL-TMB顯色液構(gòu)建后續(xù)電泳滴定檢測(cè)方法。

圖3 LCV、TMB、EL-TMB顯色液在HRP催化反應(yīng)中顯色效率比較Fig.3 Comparison of the chromogenic efficiencies between LCV,TMB,and EL-TMB chromogenic solutions under horseradish peroxidase (HRP)catalysis Experimental conditions:chromogenic reaction for 4 min at 25 ℃.

2.2 電泳滴定檢測(cè)HRP方法驗(yàn)證

以EL-TMB試劑盒構(gòu)建TMB顯色體系建立電泳滴定檢測(cè)體系對(duì)HRP進(jìn)行檢測(cè),試驗(yàn)現(xiàn)象如圖4所示。當(dāng)?shù)味ㄍǖ纼蓚?cè)未通電時(shí)(t0),樣品池中TMB·+不會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入滴定通道。當(dāng)向滴定通道施加電壓時(shí),樣品池中的TMB·+受電場(chǎng)作用進(jìn)入滴定通道中分別與凝膠中的AA發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)界面(t1)。隨著電泳滴定的進(jìn)行,界面繼續(xù)向陰極方向遷移(t2)。試驗(yàn)現(xiàn)象符合1.2.2節(jié)以及圖1中對(duì)電泳滴定檢測(cè)原理的描述。

圖4 基于TMB顯色體系的電泳滴定界面遷移照片F(xiàn)ig.4 Images of boundary motion during ET based on TMB chromogenic system Experimental conditions:0.1 mmol/L AA and 40 mmol/L KCl in 1% (1 g/100 mL)agarose gel-filled titration channel;40 mmol/L KCl in 1% (1 g/100 mL)agarose gel-filled bridge channel;40 mmol/L NaOH as anolyte;0.1 mmol/L AA and 40 mmol/L HCl as catholyte;0.073 mg/L HRP in chromogenic solution;operating voltage as 36 V;ET running for 4 min.Photos were acquired before ET running (t0),and after ET running for 2 min (t1)and 4 min (t2).

2.3 滴定通道凝膠中離子強(qiáng)度對(duì)檢測(cè)的影響

電泳通道中的離子強(qiáng)度會(huì)對(duì)電泳滴定的檢測(cè)效果帶來(lái)顯著的影響。通過(guò)改變滴定通道凝膠中KCl濃度來(lái)調(diào)節(jié)電泳通道中的離子強(qiáng)度,并觀察電泳滴定過(guò)程中界面的穩(wěn)定性。試驗(yàn)現(xiàn)象見(jiàn)圖5a。當(dāng)凝膠中的KCl濃度較低(10 mmol/L)時(shí),界面遷移速度較慢,需要較長(zhǎng)電泳滴定時(shí)間以完成檢測(cè)。當(dāng)凝膠中的離子強(qiáng)度較高(60 mmol/L)時(shí),可觀察到滴定通道中有深藍(lán)色沉淀產(chǎn)生。這可能是因?yàn)槟z中過(guò)高的離子濃度導(dǎo)致TMB·+溶解度的變化,使得TMB·+在濃度較高時(shí)發(fā)生沉淀,并進(jìn)一步破壞凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,對(duì)滴定結(jié)果產(chǎn)生干擾。當(dāng)通道中的離子強(qiáng)度適中(40 mmol/L)時(shí),界面遷移速度較快,界面形態(tài)與顏色穩(wěn)定,檢測(cè)穩(wěn)定性也較好。因此,將滴定通道凝膠中KCl濃度設(shè)置為40 mmol/L。

圖5 滴定凝膠中(a)電解質(zhì)濃度與(b)AA濃度對(duì)界面遷移的影響Fig.5 Influence of (a)electrolyte concentration and (b)AA concentration in gel on the boundary motion Experimental conditions:a.10,40,and 60 mmol/L KCl in titration and bridge channel,0.073 mg/L HRP in chromogenic solution;b.0.4,0.2,0.1,and 0.05 mmol/L AA in titration channel,0.009 mg/L HRP in chromogenic solution.Concentrations of NaOH in anolyte and HCl in catholyte were the same as KCl concentration in titration channel.Other conditions were the same as those in Fig.4.The arrow indicates the formation of precipitation.

2.4 滴定通道凝膠中AA濃度對(duì)檢測(cè)的影響

電泳通道凝膠中的AA與通道遷移的TMB·+發(fā)生反應(yīng),因此AA的濃度將直接影響界面遷移的速度。改變滴定通道凝膠中AA的濃度,觀察電泳滴定過(guò)程中界面遷移速度的變化。試驗(yàn)現(xiàn)象見(jiàn)圖5b。當(dāng)凝膠中的AA濃度較高(≥0.2 mmol/L)時(shí),界面遷移速度較慢,需要較長(zhǎng)電泳滴定時(shí)間以完成檢測(cè)。隨著凝膠中的AA濃度降低,界面遷移速度隨之加快。然而,當(dāng)凝膠中的AA濃度進(jìn)一步降低(≤0.05 mmol/L)時(shí),在試驗(yàn)中觀察到界面遷移速度漸趨于恒定,不利于檢測(cè)的進(jìn)行。綜合考慮上述因素,選擇0.1 mmol/L作為滴定凝膠中AA濃度。

2.5 電泳滴定檢測(cè)HRP標(biāo)準(zhǔn)曲線

在試驗(yàn)條件優(yōu)化之后,考察了電泳滴定檢測(cè)HRP濃度與界面遷移速度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,隨著HRP質(zhì)量濃度的上升,界面遷移速度隨之上升。進(jìn)一步考察界面遷移速度與HRP濃度的關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線為V=1.106 lgρ+3.554,對(duì)數(shù)線性擬合范圍為0.002至0.073 mg/L。式中,V代表氧化還原反應(yīng)界面在滴定通道中遷移的速率(mm/min),ρ代表HRP在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度(mg/L)。當(dāng)HRP濃度進(jìn)一步下降時(shí),檢測(cè)信號(hào)會(huì)偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線,并且界面顏色淡化,給目視讀數(shù)帶來(lái)困難。試驗(yàn)結(jié)果表明,本方法能夠在較短的檢測(cè)時(shí)間(顯色加電泳滴定僅需9 min)內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)HRP可視化的定量檢測(cè)。

同時(shí),將開(kāi)發(fā)的電泳滴定檢測(cè)HRP方法與多種已報(bào)道的HRP檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比(見(jiàn)表1)。相較于其他檢測(cè)方法,電泳滴定檢測(cè)HRP能夠達(dá)到較好的檢測(cè)靈敏度,且通過(guò)延長(zhǎng)顯色反應(yīng)時(shí)間,檢測(cè)靈敏度能夠得到進(jìn)一步的提升。同時(shí),電泳滴定檢測(cè)方法不依賴(lài)于傳統(tǒng)檢測(cè)器以及分析儀器設(shè)備,在檢測(cè)成本以及便攜性上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

表1 氧化還原反應(yīng)界面-電泳滴定檢測(cè)方法與數(shù)種已報(bào)道的HRP檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of ET-redox reaction boundary (RB)method with several reported detection methods for HRP assay

圖6 電泳滴定檢測(cè)HRP的(a)界面遷移距離和(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=3)Fig.6 (a)Boundary motion distance and (b)calibration curve of HRP detection with developed ET method (n=3) Experimental conditions:0.002,0.004,0.009,0.018,0.036,and 0.073 mg/L HRP in chromogenic solution;photos were acquired after ET running for 4 min.Other conditions were the same as those in Fig.4.V:moving velocity of the RB in titration channel (mm/min);ρ:mass concentration of horseradish peroxidase detected in reaction system (mg/L);R2:correlation coefficient.

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了基于氧化還原反應(yīng)界面的電泳滴定即時(shí)檢測(cè)HRP方法。結(jié)果表明,該檢測(cè)方法具有較高的檢測(cè)靈敏度、優(yōu)異的檢測(cè)速度、溫和的檢測(cè)條件、較低的檢測(cè)成本(不依賴(lài)檢測(cè)儀器、泵等設(shè)備)?？赏ㄟ^(guò)運(yùn)用抗體、核酸適配體技術(shù)將待測(cè)物質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)化為HRP酶信號(hào),該方法有望實(shí)現(xiàn)對(duì)于多種重要目標(biāo)物質(zhì)的高靈敏、即時(shí)、低成本的檢測(cè)。相關(guān)的研究正在進(jìn)行中。