呂佳樂(lè),劉正才,姚閩娜*,林元地

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.福州海關(guān)技術(shù)中心,福建 福州 350001)

沙奎那韋、利托那韋、奈非那韋和茚地那韋是一類高效和高選擇性的蛋白酶抑制劑,屬于抗病毒類藥物[1]。而病毒缺少完整的酶系統(tǒng),將無(wú)法獨(dú)立存活,因此它必須侵入易感的宿主細(xì)胞,依靠宿主細(xì)胞的酶系統(tǒng)、原料和能量復(fù)制病毒的核酸,借助宿主細(xì)胞的核糖體翻譯病毒的蛋白質(zhì)[2]。因蛋白酶抑制劑能與蛋白酶分子活性中心上的一些基團(tuán)結(jié)合,使蛋白酶活力下降,甚至消失,從而達(dá)到抵抗病毒的作用。早在2005年,中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第560號(hào)就規(guī)定,禁止將人用抗病毒藥移植獸用,但為了節(jié)約成本,許多不法商家依然將其用于畜禽的預(yù)防感染和治療疾病上。2012年央視曝光的“速生雞”事件就是一些養(yǎng)殖企業(yè)為快速獲得經(jīng)濟(jì)利益,縮短雞的養(yǎng)殖周期,在雞飼料中違規(guī)添加利巴韋林和鹽酸金剛烷胺等抗病毒藥物。長(zhǎng)期大量使用這些藥物,會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物中毒,并誘發(fā)病毒菌株產(chǎn)生變異,這將嚴(yán)重威脅人類健康[3,4]。因此,建立雞肉中蛋白酶抑制劑的殘留檢測(cè)方法非常重要。

目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)沙奎那韋、利托那韋、奈非那韋、茚地那韋的主要方法有高效液相色譜法[5]、反向高效液相色譜法[6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-9]、高效液相色譜-紫外法[10]等。目前關(guān)于這4種藥物的報(bào)道主要集中在血漿和尿液中藥物含量的測(cè)定方面,而動(dòng)物性食品中殘留檢測(cè)方法的報(bào)道相對(duì)較少。梁公文等[8]采用反向高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)小鼠血漿和腦組織中沙奎那韋的含量,操作過(guò)程繁瑣;時(shí)美慧等[11]采用Thermo Hypersil GOLD色譜柱，以正離子模式、選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)方式建立了快速測(cè)定人血漿中洛匹那韋和利托那韋濃度的LC-MS/MS方法,但只選取了一對(duì)二級(jí)碎片離子進(jìn)行分析和檢測(cè);Chi等[12]建立了LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中蛋白酶抑制劑的含量,但種類不夠全面。因此建立一種檢測(cè)全面、靈敏度高、特異性強(qiáng)的多殘留檢測(cè)方法以應(yīng)用于動(dòng)物組織中蛋白酶抑制劑藥物的測(cè)定尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)以雞肉為研究對(duì)象,結(jié)合固相萃取的強(qiáng)凈化能力和UPLC-MS/MS的抗基質(zhì)干擾能力,建立了檢測(cè)沙奎那韋、利托那韋、奈非那韋、茚地那韋的多殘留分析方法。該法靈敏度高,選擇性好,定性定量準(zhǔn)確,抗干擾能力強(qiáng),定量限(LOQ)滿足各個(gè)化合物殘留限量的要求,可用于雞肉中4種蛋白酶抑制劑的殘留檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

API5500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧電離(ESI)源(美國(guó)Applied Biosystems公司);CR21N高速冷凍離心機(jī)(日本工機(jī)有限公司);XK80-A旋渦混合器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司);HN200多功能氮吹儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司);Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

沙奎那韋(CAS號(hào):127779-20-8)、利托那韋(CAS號(hào):155213-67-5)、奈非那韋(CAS號(hào):159989-64-7)、茚地那韋(CAS號(hào):150378-17-9)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%,加拿大Toronto Research Chemicals公司);混合型陽(yáng)離子交換柱(MCX柱,60 mg/3 mL;美國(guó)Waters公司);乙腈、甲醇、氨水(色譜純,德國(guó)Merck公司);三氯乙酸(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用雞肉樣品購(gòu)自超市。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取沙奎那韋、利托那韋、奈非那韋、茚地那韋標(biāo)準(zhǔn)品各5.00 mg,用甲醇分別溶于50 mL棕色容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃下保存,備用。再用50%(v/v)甲醇逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液;臨用時(shí),以空白基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

1.2.1提取

稱取5.0 g均質(zhì)后的雞肉樣品,置于50.0 mL塑料離心管中,再加入25.0 mL 30%(v/v)乙腈水溶液(含1%(v/v)三氯乙酸)、0.5 g中性氧化鋁,振蕩混勻3 min,于0～4 ℃以15 000 r/min離心8 min,取上清液過(guò)濾,濾液待凈化。

1.2.2凈化

依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水、3.0 mL 1%(v/v)三氯乙酸水溶液活化MCX柱;取5.0 mL濾液，加入5.0 mL水，混勻，上樣,依次用3.0 mL 1%(v/v)三氯乙酸水溶液、3.0 mL水、3.0 mL甲醇-水(1∶1,v/v)淋洗MCX柱,然后用3.0 mL氨水-甲醇(5∶95,v/v)洗脫,收集洗脫液,置于45 ℃下氮吹,最后添加1.0 mL乙腈-水(4∶6,v/v)溶液溶解,過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

表1 4種蛋白酶抑制劑的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Main MS parameters of the four protease inhibitors

* Quantitative ion.

圖1 4種蛋白酶抑制劑的二級(jí)離子碎片質(zhì)譜圖及其主要裂解方式Fig.1 Secondary ion fragment mass spectra of the four protease inhibitors and their main fragmentation pathways

1.3 色譜條件

色譜柱:Luna?C8柱(150 mm×2 mm,3 μm);柱溫:40 ℃。流動(dòng)相:A為0.2%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨),B為乙腈;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.5 min,95%A;1.5～5.0 min,95%A～30%A;5.0～9.0 min,30%A～95%A。進(jìn)樣量:5 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

電離模式:ESI+;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;離子源溫度:500 ℃;離子源噴霧電壓(ionspray voltage):5 500 V;氣簾氣(curtain gas)壓力:0.276 MPa;霧化氣(gas 1)壓力:0.345 MPa;加熱輔助氣(gas 2)壓力:0.345 MPa。定性和定量離子對(duì)、碰撞能量(CE)、去簇電壓(DP)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

分別配制1.0 mg/L的4種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入ESI源中。首先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖全掃描,確定母離子,然后對(duì)準(zhǔn)母離子進(jìn)行子離子掃描,二級(jí)離子碎片掃描質(zhì)譜圖及可能的斷裂規(guī)律見圖1。分別選擇沙奎那韋、利托那韋、奈非那韋、茚地那韋豐度相對(duì)最強(qiáng)的1對(duì)碎片離子m/z671.4/570.5、721.5/296.2、568.6/330.2、614.6/421.1作定量離子對(duì),次強(qiáng)的一兩對(duì)碎片離子作定性離子對(duì),然后分別優(yōu)化子離子的碰撞能量,最終在MRM模式下優(yōu)化霧化氣壓力、干燥氣溫度和流量等參數(shù)。

2.2 色譜條件的選擇

色譜柱的選擇對(duì)樣品的分離十分重要,通常不同類型的填料對(duì)同一樣品有不同的保留效果。有文獻(xiàn)[12]使用Zorbax XDB C8柱測(cè)定人血漿中蛋白酶抑制劑的含量。本文重點(diǎn)比較了Kinetex?C18(100 mm×2 mm,2.6 μm)、Luna?C8(150 mm×2 mm,3 μm)2種反相液相色譜柱和ACQUITY UPLC?BEH HILIC柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)對(duì)4種目標(biāo)化合物的分離情況。結(jié)果表明,4種目標(biāo)化合物在采用C18色譜柱時(shí)能獲得較好的分離效果,但利托那韋出現(xiàn)嚴(yán)重的色譜峰拖尾現(xiàn)象,改變流動(dòng)相梯度條件仍然不能有效改善;采用HILIC柱可改善利托那韋的分離效果,但對(duì)整類化合物分離效果不太理想,而且響應(yīng)值降低,可能是因?yàn)榛衔锍龇鍟r(shí)離子源的水相比例較高,高濃度的鹽抑制了化合物的響應(yīng)信號(hào);采用C8柱時(shí),4種物質(zhì)均可有效分離且響應(yīng)值較高。因此,選用C8柱,以酸性乙酸銨溶液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,4種化合物能較好地保留與分離。

2.3 提取條件的選擇

圖2 不同提取溶劑對(duì)4種蛋白酶抑制劑回收率的影響(n=3)Fig.2 Influence of different extraction solvents on the recoveries of the four protease inhibitors (n=3) All the extraction solvents contained 1% (v/v)trichloroacetic acid.

4種蛋白酶抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1,其均含有2個(gè)或2個(gè)以上的氨基,屬于有機(jī)堿,因此在提取溶液中添加適量的酸有利于藥物的提取?？紤]到雞肉組織中蛋白質(zhì)含量高、雜質(zhì)多等特點(diǎn),綜合三氯乙酸具有沉淀蛋白質(zhì)及雜質(zhì)的作用[13],因此首先考慮添加三氯乙酸使提取溶液呈酸性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),三氯乙酸的體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí),4種化合物的提取回收率最高。為取得較好的提取效果,實(shí)驗(yàn)分別考察了三氯乙酸的體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí),乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷作為提取溶劑對(duì)雞肉中4種蛋白酶抑制劑回收率的影響(見圖2)。結(jié)果表明,對(duì)于雞肉樣品,采用乙酸乙酯、丙酮、甲醇、三氯甲烷提取時(shí),4種目標(biāo)化合物的回收率均不能同時(shí)超過(guò)60%;采用乙腈提取時(shí),4種目標(biāo)物的回收率為67.6%～85.7%;采用二氯甲烷提取時(shí),4種目標(biāo)物的回收率為71.1%～94.3%。雖然二氯甲烷的提取效果相對(duì)較好,但雞肉中油脂含量高,二氯甲烷比乙腈更容易將雞肉中的油脂提取出來(lái),不利于后續(xù)凈化。乙腈對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用較強(qiáng),進(jìn)一步優(yōu)化乙腈的比例,發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用30%(v/v)乙腈水溶液提取時(shí),4種目標(biāo)物的回收率最佳。因此最終確定提取溶液為30%(v/v)乙腈水溶液(含1%(v/v)三氯乙酸)。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

圖3 4種目標(biāo)化合物在固相萃取柱上的洗脫曲線Fig.3 Elution curves of the four target compounds on SPE column

根據(jù)化合物的特點(diǎn),本文重點(diǎn)比較了親水親脂平衡HLB柱和MCX柱對(duì)樣品中所有目標(biāo)物的凈化效果。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用HLB柱時(shí),利托那韋、茚地那韋的回收率可達(dá)62.3%和91.1%,但沙奎那韋和奈非那韋的回收率較低,無(wú)法滿足分析要求,而使用MCX柱時(shí),沙奎那韋、奈非那韋、茚地那韋的回收率為83.5%～104.0%,但利托那韋的回收率相對(duì)較低。為解決此問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)從上樣溶液的體積、淋洗液以及洗脫液等方面進(jìn)行了選擇和優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，在上樣的濾液中加入5 mL水,淋洗液甲醇的體積分?jǐn)?shù)降為50%時(shí),利托那韋在MCX柱上能較好地保留,且其他3種化合物均有較好的回收率。以氨水-甲醇(5∶95,v/v)為洗脫液時(shí)的洗脫曲線見圖3?？梢钥闯?使用1 mL時(shí)，大量蛋白酶抑制劑被洗脫,使用3 mL時(shí),蛋白酶抑制劑基本全部洗脫。因此,最終洗脫體積設(shè)為3 mL。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然具有高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn),但普遍存在基質(zhì)效應(yīng),會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響。目前常采用兩種方法消除基質(zhì)效應(yīng),分別為柱后灌注法和提取后加標(biāo)法[14,15]。本實(shí)驗(yàn)采用提取后加標(biāo)法,將空白雞肉樣品按1.2節(jié)進(jìn)行前處理，獲得的基質(zhì)提取液配制基質(zhì)曲線,用乙腈-水(4∶6,v/v)配制同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,基質(zhì)效應(yīng)=(k1-k2)/k1×100%(k1為基質(zhì)曲線的斜率,k2為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)。結(jié)果表明,沙奎那韋、利托那韋、奈非那韋和茚地那韋在雞肉中均有不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME分別為19%、13%、6%和7%。因此,本文采用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液來(lái)減弱基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.6 線性方程、檢出限和定量限

配制質(zhì)量濃度為0.5、1、2、4、10、20 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以目標(biāo)組分峰面積(y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x,μg/L)作線性回歸分析(見表2)。結(jié)果表明,4種目標(biāo)化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。在雞肉空白樣品中加入不同水平的蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品,按照1.2節(jié)前處理后進(jìn)行測(cè)定,以3倍和10倍信噪比(S/N)為檢出限(LOD)和定量限(LOQ),4種蛋白酶抑制劑的檢出限和定量限分別為0.06～0.30 μg/kg和0.20～0.90 μg/kg(見表2)。

表2 4種蛋白酶抑制劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r2),limits of detection (LODs)and limits of quantification (LOQs)of the four protease inhibitors

y:peak area;x:mass concentration,μg/L.

2.7 回收率和精密度

向空白雞肉樣品中進(jìn)行1.0、2.0、10.0 μg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)加標(biāo)水平做6組平行,按1.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理,在1.3節(jié)和1.4節(jié)條件下進(jìn)行測(cè)定,采用標(biāo)準(zhǔn)添加空白樣品法校正基質(zhì)效應(yīng);日間精密度試驗(yàn)每個(gè)樣品重復(fù)分析2次,連續(xù)3 d分析,結(jié)果見表3。雞肉中4種目標(biāo)化合物的平均回收率為69.0%～106.0%,日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.2%～13.8%和3.6%～14.6%。說(shuō)明該方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度?？瞻纂u肉樣品和加標(biāo)雞肉樣品(1.0 μg/kg)的MRM色譜圖見圖4。

表3 雞肉中4種蛋白酶抑制劑的加標(biāo)回收率和日內(nèi)、日間精密度Table 3 Spiked recoveries and intra-day and inter-day precisions of the four protease inhibitors in chicken samples

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

用本文建立的檢測(cè)方法對(duì)購(gòu)于市場(chǎng)上的30份雞肉樣品進(jìn)行檢測(cè),4種目標(biāo)化合物均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)雞肉中蛋白酶抑制劑的分析方法。該法簡(jiǎn)單高效,靈敏度高,選擇性好,適用于雞肉中4種蛋白酶抑制劑的殘留分析。