張 靖,郭攀攀,李惠麗,申世剛*,竇海洋,*

(1.河北大學化學與環(huán)境科學學院,河北 保定 071002;2.河北大學醫(yī)學院,河北 保定 071000)

小米又稱粟,原產(chǎn)于我國,是我國北方半干旱、干旱地區(qū)種植的主要糧食作物,營養(yǎng)豐富,兼具藥用價值。珍珠栗、狐尾栗、黍子和手指小米等都是小米的重要品種。小米主要成分為淀粉,其含量約為60%～70%。小米淀粉是食品進一步加工的基礎原料,小米淀粉的理化性質(zhì)和結構影響食用的品質(zhì)[1]。因此,準確表征小米淀粉的理化性質(zhì)和結構對于獲得滿足特定功能的小米產(chǎn)品至關重要。

目前,常用分離淀粉的方法主要有尺寸排阻色譜法(size-exclusion chromatography,SEC)和非對稱場流分離技術(asymmetrical flow field-flow fractionation,AF4)。SEC是一種基于樣品尺寸分離的方法,其分離范圍為103～106g/mol。SEC在表征直鏈淀粉時可以獲得準確的摩爾質(zhì)量分布,但是在表征支鏈淀粉時,剪切作用導致支鏈淀粉降解,測得的摩爾質(zhì)量偏低[2,3]。不同于SEC,AF4是基于樣品的分子擴散和垂直于主體流動的流場相互作用的分離方法。AF4沒有固定相和填充材料,具有廣泛的尺寸檢測范圍(1 nm～50 μm),適用于剪切力敏感的樣品的分離。近年來,AF4已應用于分離表征脂蛋白[4-6]、納米顆粒[7,8]、多糖[9]等。此外,AF4與多角度激光光散射檢測器(multi-angle light scattering,MALS)和示差折光檢測器(differential refractive index,dRI)(AF4-MALS-dRI)可以同時提供樣品的回轉半徑(radius of gyration,Rg)分布、摩爾質(zhì)量(molar mass,Mw)分布、表觀密度、分子結構(Rg/Rh)等信息[10]。

文獻[11]報道,小米淀粉顆粒大小不一,且摩爾質(zhì)量分布范圍廣,采用一般的分離方法很難準確表征小米淀粉。目前未見關于AF4分離表征小米的報告。本文建立了AF4-MALS-dRI聯(lián)用技術分離表征小米淀粉的方法。該方法具靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Eclipse AF4場流分離系統(tǒng)(德國Wyatt公司);DAWN EOS多角度激光光散射檢測器(美國Wyatt公司);1260 InfinityⅡ示差折光檢測器;Agilent 1260液相泵(德國Agilent公司);MS-H550-Pro磁力攪拌器(北京大龍興創(chuàng)實業(yè)有限公司);Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);DHG-914385-Ⅲ電熱鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);SQP電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);PE28 pH計(梅特勒-托利多精密儀器有限公司)。

硝酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉、疊氮化鈉(上海麥克林生化科技有限公司),鹽酸(北京化工),牛血清蛋白(Mw=6.6×104g/mol)、馬脾鐵蛋白(美國Sigma-Aldrich公司),所用試劑均為分析級。小米由河北省農(nóng)林科學院谷子研究所提供。

1.2 小米淀粉樣品制備

小米淀粉的提取:準確稱取20 g小米,置于200 mL燒杯中,加入26.6 mL pH 7.2磷酸緩沖溶液,密封,浸泡48 h。將浸泡的小米進行研磨過篩(200目),加入到10 mL的離心管中,以6 000 r/min的速度離心7 min,去除上清液。加入90%(體積分數(shù))乙醇,在相同的轉速下離心3次,最后將獲得的小米淀粉置于45 ℃的鼓風干燥箱中烘干48 h。

小米淀粉的溶解:準確稱取10 mg小米淀粉,置于20 mL試劑瓶中,加入1.0 mL 1 mol/L NaOH溶液,在室溫下以200 r/min的速度磁力攪拌6 min。將試劑瓶置于70 ℃水浴中以160 r/min的速度攪拌4 min。加入8.0 mL載液,繼續(xù)攪拌2 h。加入1.0 mL 1 mol/L HCl溶液,攪拌2 min,取出,室溫冷卻[9]。

表1 洗脫程序Table 1 Elution procedure

Vc,initial:initial cross flow rate;Vc,final:final cross flow rate.

1.3 小米淀粉AF4分析條件

本研究采用AF4長池道:其中聚酯墊片厚度為350 μm,可再生纖維素膜的截留量為10 kDa;流動相為10 mmol/L pH 7.00 NaNO3水溶液(加入3 mmol/L NaN3,抑制載液中微生物的生長),樣品進樣體積為50 μL,進樣質(zhì)量濃度為0.50 g/L,進樣流速為0.2 mL/min,檢測器流速為1.0 mL/min,交叉流流速由1.2 mL/min指數(shù)衰減到0 mL/min,半衰期(t1/2)為3 min,洗脫程序見表1。所獲得的AF4數(shù)據(jù)采用ASTRA 6.1.7進行處理,折射率增量值(dn/dc)為0.146 mL/g,數(shù)據(jù)擬合方式為Berry[14]。

2 AF4原理

AF4分離池道主要由聚碳酸酯上殼、聚酯梯形墊片、超濾膜(積累壁)和不銹鋼滲透熔塊下板組成。其分離原理如圖1所示:在分離的流道內(nèi),中心線位置處的流速最大,從中心線向兩側流速逐漸減小。當樣品從進樣口B進入流道后,在外加場力的作用下向積累壁運動,與此同時樣品自身布朗運動產(chǎn)生向上的擴散力,在這兩個力的共同作用下最終形成平衡層。粒徑小的顆粒具有較高的擴散系數(shù),形成的平衡層靠近流道中心,此處具有較大流速而被先洗脫出來。

圖1 非對稱場流分離原理Fig.1 Principle of AF4 (asymmetrical flow field-flow fractionation)

AF4-MALS-dRI可以同時提供樣品的Rg和Mw分布[12]:

(1)

其中,K為光學常數(shù);c為樣品質(zhì)量濃度(kg/L);Rθ為瑞利比,指散射光強度與入射光強度的比,受到入射光的強度、散射的體積、散射角等因素的影響;λ為入射光波長;θ為光散射角。

在AF4正常洗脫模式中,流體力學半徑Rh可以通過測量的保留時間tr和Stokes-Einstein方程推導出[13]:

(2)

其中,k為玻爾茲曼常數(shù),T為絕對溫度(K),v0為空隙體積(mL),t0為空隙時間(min),w為池道高度(cm),η為載液的黏度(g/(cm·min)),vc為交叉流流速(mL/min)。

3 結果與討論

3.1 AF4系統(tǒng)性能的驗證

為了獲得準確的分析數(shù)據(jù),采用牛血清蛋白作為測試的標準樣品,恒定交叉流流速為5 mL/min，其他按1.3節(jié)分析條件對AF4系統(tǒng)性能進行驗證。結果如圖2所示,在tr=4.5、6.2和7.5 min處出現(xiàn)了3個洗脫峰,分別對應牛血清蛋白的單體、二聚體、三聚體,測定的牛血清蛋白單體的Mw為6.7×104g/mol,與廠家提供值6.6×104g/mol基本一致,表明AF4系統(tǒng)有良好的分離性能。結果顯示,牛血清蛋白的二聚體、三聚體的AF4-MALS信號與AF4-UV、AF4-dRI信號強度有明顯的差異,這是因為AF4-MALS信號受樣品粒徑大小和濃度因素的影響,而AF4-dRI和AF4-UV信號只受樣品濃度影響。本文MALS信號來源于光散射角90°的信號源(MALS 90°)。

圖2 牛血清蛋白的AF4-UV-MALS-dRI分離譜圖和Mw分布圖Fig.2 AF4-UV-MALS-dRI (AF4 coupled with ultraviolet-visible,multi-angle light scattering,and differential refractive index detectors)fractograms and Mw(molar mass)distributions of bovine serum albumin

圖3 不同溶解溫度對小米淀粉溶解影響的AF4-MALS-dRI分離譜圖、Rg和Mw分布圖Fig.3 AF4-MALS-dRI fractograms ,Rg(radius of gyration)and Mw(relative molecular mass)distributions of millet starch obtained at different dissolution temperatures a.AF4-dRI and Rg of millet starch;b.AF4-MALS and Mw of millet starch;c.AF4-dRI and Rg of millet starch filtered through a 0.45 μm filter;d.AF4-MALS and Mw of millet starch filtered with 0.45 μm.MALS 90°:MALS signal was observed at the scattering angle of 90°.

3.2 小米淀粉的溶解

研究了不同溶解溫度對小米淀粉溶解的影響。按1.3節(jié)條件進行分析,結果如圖3所示,小米淀粉Rg分布范圍為15～160 nm,Mw分布范圍為5×105～2×108g/mol。當水浴溫度為70 ℃時,AF4-dRI信號在tr=6.0～11.0 min處出現(xiàn)凸起,對應的Rg分布和Mw分布出現(xiàn)相同的現(xiàn)象。這可能是由于小米淀粉未全溶解發(fā)生共洗脫現(xiàn)象。共洗脫是指在AF4分離過程中,粒徑大的顆粒與粒徑小的顆粒同時洗脫出來[14,15]。為了證明此現(xiàn)象,采用0.45 μm的聚醚砜(PES)針式過濾膜將小米淀粉溶液過濾,結果如圖3c和3d所示,tr=6.0～11.0 min處的凸起消失,對應的Rg分布和Mw分布呈現(xiàn)緩慢上升趨勢,表明水浴溫度為70 ℃時,小米淀粉未完全溶解。當水浴溫度為75 ℃時,AF4-MALS-dRI信號增強,但仍存在共洗脫現(xiàn)象,表明小米淀粉仍未完全溶解。當水浴溫度為80 ℃時,AF4-dRI信號進一步增強,且共洗脫現(xiàn)象消失,表明小米淀粉溶解較好。在該溫度下,AF4-dRI信號主要呈現(xiàn)兩個洗脫峰,第一個洗脫峰對應的是直鏈淀粉,第二個洗脫峰對應的是支鏈淀粉。當水浴溫度升高到85 ℃時,AF4-MALS-dRI信號的第一個洗脫峰明顯增強,第二個洗脫峰信號降低,表明支鏈淀粉發(fā)生了降解。綜上,水浴溫度為80 ℃為溶解小米淀粉的適宜溫度。

3.3 AF4分析條件的優(yōu)化

3.3.1進樣量

樣品進樣量是影響AF4分析結果的主要因素之一。當進樣量過少時,樣品洗脫峰的信號低;當進樣量過高時,樣品出現(xiàn)過載現(xiàn)象導致樣品的洗脫峰發(fā)生偏移,保留時間也會發(fā)生改變,影響分析結果的準確性[16]。本研究通過改變進樣濃度研究了進樣量對小米淀粉AF4分析結果的影響。進樣質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50和1.00 g/L,其他條件同1.3節(jié)。結果如圖4所示,當進樣質(zhì)量濃度為0.25 g/L時,AF4-MALS-dRI信號較弱。當進樣質(zhì)量濃度為0.50 g/L時,AF4-MALS-dRI信號增加。當進樣質(zhì)量濃度增加到1.00 g/L時,AF4-MALS-dRI信號繼續(xù)增加,但部分樣品從空隙峰中洗脫出來。綜合考慮樣品空隙峰與樣品峰的分離度和樣品洗脫峰的信號強度,選擇進樣質(zhì)量濃度為0.50 g/L。

圖4 不同進樣濃度對小米淀粉影響的AF4-MALS-dRI分離譜圖、Rg和Mw分布圖Fig.4 AF4-MALS-dRI fractograms ,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained at different sample concentrations

3.3.2交叉流流速

根據(jù)AF4理論,交叉流流速是影響分離效果的重要因素。增加交叉流流速可以提高樣品的分離度。研究了不同的交叉流流速對小米淀粉AF4分離結果的影響。交叉流流速分別為1.0、1.2和1.4 mL/min,其他分析條件同1.3節(jié)。結果如圖5所示,當樣品的交叉流流速為1.0 mL/min時,AF4-dRI信號中的樣品空隙峰與樣品峰分離度較差,這是由于交叉流流速小,分樣品從空隙峰中洗脫出來。當交叉流流速為1.2 mL/min時,AF4-dRI信號的樣品空隙峰與樣品峰進一步分離,但峰展寬增加,其原因是交叉流流速增加,使樣品更接近于過濾膜表面,樣品與過濾膜之間的相互作用增強,洗脫時間延長。當交叉流流速增加到1.4 mL/min時,AF4-dRI信號降低且峰展寬進一步增加。綜合考慮樣品空隙峰與樣品峰的分離度和樣品洗脫峰的信號強度,選擇交叉流流速為1.2 mL/min。

圖5 不同交叉流流速下小米淀粉的AF4-MALS-dRI分離譜圖、Rg和Mw分布圖Fig.5 AF4-MALS-dRI fractograms ,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained with different cross-flow rates

3.3.3t1/2

在梯度洗脫程序中,t1/2影響著樣品洗脫時間和分離度。研究了不同t1/2對小米淀粉AF4分離結果的影響。t1/2分別為2、3和4 min,其他分析條件同1.3節(jié)。結果如圖6所示,當t1/2=2 min時,AF4-dRI信號在tr=2～5 min處出現(xiàn)了大的凸起,其原因可能是由于交叉流流速指數(shù)衰減速度太快,樣品峰的分離度降低。當t1/2=3 min時,AF4-MALS-dRI信號增強,Rg分布和Mw的分布與圖5基本一致,表明小米淀粉在該t1/2下洗脫完全。當t1/2=4 min時,AF4-MALS-dRI信號減弱且洗脫峰變寬,其原因可能是由于t1/2增大,交叉流流速指數(shù)衰減速度變慢,洗脫時間延長。綜合考慮樣品空隙峰與樣品峰的分離度和樣品洗脫峰的信號強度,選擇t1/2為3 min。

圖6 不同t1/2小米淀粉的AF4-MALS-dRI分離譜圖、Rg和Mw分布圖Fig.6 AF4-MALS-dRI fractograms ,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained with different half-lives (t1/2)

3.3.4載液離子強度

載液離子強度影響樣品顆粒表面雙電子層厚度和表面電勢,進而影響樣品的分離效果[17]。研究了不同離子強度對小米淀粉AF4分離結果的影響。pH 7.00 NaNO3載液濃度分別為10、50和100 mmol/L,其他條件同1.3節(jié)。結果如圖7所示,隨著載液濃度從10 mmol/L增加到100 mmol/L,AF4-dRI空隙峰與樣品峰的分離度逐漸增加,但樣品峰的信號減弱,其原因可能是由于載液離子強度增加,樣品顆粒表面的雙電子層厚度減小,使樣品更接近于AF4過濾膜表面,增加了樣品與AF4過濾膜交聯(lián)。綜合考慮樣品空隙峰與樣品峰的分離度和樣品洗脫峰的信號強度,選擇載液濃度為10 mmol/L pH 7.00 NaNO3。

圖7 不同離子強度小米淀粉的AF4-MALS-dRI分離譜圖、Rg和Mw分布圖Fig.7 AF4-MALS-dRI fractograms,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained with different ionic strengths

3.3.5載液pH

研究了載液的不同pH值對小米淀粉AF4分離結果的影響。載液pH值分別為5.00、7.00和9.00,其他條件同1.3節(jié)。結果如圖8所示,當載液的pH值從5.00增加到9.00時,AF4-MALS-dRI信號的空隙峰與樣品峰的分離度及信號強度呈先增加后減小的趨勢,可能是由于載液的pH過酸或過堿,都會影響樣品顆粒與過濾膜表面之間的作用力。綜合考慮樣品空隙峰與樣品峰的分離度和樣品洗脫峰的信號強度,選擇載液的pH=7.00。

圖8 不同pH小米淀粉的AF4-MALS-dRI分離譜圖、Rg和Mw分布圖Fig.8 AF4-MALS-dRI fractograms,Rg,and Mw distributions of millet starch obtained with different pH values

3.4 重現(xiàn)性

為了驗證小米淀粉溶解及AF4-MALS-dRI方法的重現(xiàn)性。在1.3節(jié)條件下,對3個小米淀粉樣品進行測定。結果如圖9所示,3個樣品的AF4-dRI信號和AF4-MALS信號的趨勢及強度基本一致,Rg相對標準偏差為3.4%,Mw相對標準偏差為7.0%。

圖9 小米淀粉樣品的AF4-MALS-dRI分離譜圖、Rg和Mw分布圖的重現(xiàn)性Fig.9 Repeatabilities of AF4-MALS-dRI fractograms,Rg,and Mw distributions for analysis of millet starch

3.5 小米淀粉的結構表征

在優(yōu)化的條件下,探究了小米淀粉的結構?；贏F4與MALS和dRI聯(lián)用(見公式1)結合AF4理論(見公式2)可以獲得小米淀粉的結構參數(shù)(Rg/Rh)和表觀密度。結果如圖10所示,表觀密度分布和Rg/Rh的分布主要在107～108g/mol范圍內(nèi),隨著Mw的增加,表觀密度先快速地降低后趨于平緩,表明小米淀粉分子隨著摩爾質(zhì)量的增加從緊密的狀態(tài)變得疏松;Rg/Rh的比值范圍為0.9～1.6。文獻[18]報道,Rg/Rh的比值分布范圍為1.0～1.5時,樣品分子結構為多分支結構。在摩爾質(zhì)量107～108g/mol范圍,小米淀粉Rg/Rh的比值范圍為0.9～1.6,主要為多分支結構。

圖10 小米淀粉的表觀密度和Rg/RhFig.10 Apparent density and Rg/Rh of millet starch

4 結論

通過對AF4分析條件的優(yōu)化,建立了AF4-MALS-dRI聯(lián)用技術分離表征小米淀粉的方法。在該優(yōu)化條件下,考察了AF4-MALS-dRI分離表征小米淀粉的重現(xiàn)性,同時探究了小米淀粉的表觀密度和構象。結果表明,該方法具有良好的重現(xiàn)性,在摩爾質(zhì)量107～108g/mol范圍,小米淀粉分子主要為多分支結構。實驗結果可為小米食品加工行業(yè)提供數(shù)據(jù)支持。