賀惠文，孫黎平

(揚(yáng)州大學(xué)廣陵學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

桃(Amygdalus persica)果作為一種日常水果年產(chǎn)量較高，但在其采收后的貯藏和運(yùn)輸過程中經(jīng)常會(huì)有爛果損失。引起桃果腐爛的原因是各種病原菌通過傷口或皮孔侵入，病果還會(huì)進(jìn)一步感染周圍健康桃果造成更大經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，生產(chǎn)上桃果保鮮處理主要依賴于化學(xué)手段，而生物手段以其高效、安全的特點(diǎn)也受到廣泛關(guān)注[2]。與化學(xué)防治相比，生物防治在保證果實(shí)品質(zhì)同時(shí)，無化學(xué)藥劑殘留，更符合當(dāng)代綠色環(huán)保的消費(fèi)理念[3]。

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)W10菌株對桃褐腐病、桃枝枯病等多種植物致病菌均有抑制作用，其生防作用機(jī)理主要是具有抗菌蛋白活性[4]。為了探討地衣芽孢桿菌W10菌液及抗菌蛋白對貯藏期桃果的保鮮作用，本文測定不同處理桃果貯藏期的色澤、硬度、可溶性固形物含量、失重率、腐爛率等指標(biāo)，為地衣芽孢桿菌W10生防菌在桃果采后保鮮中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

地衣芽孢桿菌W10菌株從番茄根際土壤中分離獲得，由揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院植物病理組實(shí)驗(yàn)室提供[6]。

桃果品種為‘滬油018’，成熟度為底色轉(zhuǎn)白、50%表皮著紅色時(shí)采收，由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所提供[7]。

1.2 方法

采摘后桃果分為4組，每組30個(gè)，分別用菌液(1010cfu·mL-1)、抗菌蛋白(3.0 mg·mL-1)、多菌靈(1000 μg·mL-1)以及無菌水(對照)浸泡 5 min 后晾干，于25 ℃、相對濕度70%～75%環(huán)境中貯藏。

1.2.1 菌液制備

地衣芽孢桿菌W10菌株用固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)活化后，接種于NA培養(yǎng)液中，經(jīng)28 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h得菌液。用平板計(jì)數(shù)法測量菌液濃度為1010cfu·mL-1[8]。

1.2.2 抗菌蛋白制備

菌液離心后，取上清液用0.45 μm細(xì)菌濾器過濾得培養(yǎng)濾液；濾液加硫酸銨達(dá)30%飽和度后靜置12 h使蛋白析出。離心收集粗蛋白，用Tris-HCl緩沖液懸浮并反復(fù)透析6次，經(jīng)0.22 μm細(xì)菌濾器過濾得到分子量為46 kDa抗菌蛋白[9]。為保證抗菌蛋白活性穩(wěn)定，所有操作均在4 ℃下進(jìn)行[10]。用紫外吸收法測量抗菌蛋白濃度。按表1配制不同濃度蛋白溶液，分別測定 OD280值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線列出方程。測定抗菌蛋白 OD280值，根據(jù)牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算抗菌蛋白濃度為4.444 mg·mL-1，稀釋成 3.0 mg·mL-1備用[11]。

表1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度Table 1 Standard protein concention

1.3 桃果保鮮指標(biāo)測定

1.3.1 色澤

隨機(jī)取10個(gè)桃果，用WSC-80C色差計(jì)(北光世紀(jì)儀器)測量桃果縫合線左右赤道部位色差L*值[12]，每個(gè)桃果重復(fù)三次，取平均值。

1.3.2 硬度

隨機(jī)取10個(gè)桃果，去除桃果縫合線左右赤道部位果皮后，用GY-1果實(shí)硬度計(jì)(德國Bareiss)測量桃果硬度[13]，每個(gè)桃果重復(fù)三次，取平均值。

1.3.3 可溶性固形物含量

隨機(jī)取10個(gè)桃果，取桃果縫合線左右赤道部位果肉，去皮榨汁，用ATAGO折射儀(日本愛拓)測定桃果可溶性固形物含量[14]，每個(gè)桃果重復(fù)三次，取平均值。

1.3.4 失重率

隨機(jī)取10個(gè)桃果，記錄桃果原始重量，處理后每隔2 d稱重計(jì)算桃果失重率，每個(gè)桃果重復(fù)三次，取平均值。

1.3.5 腐爛率

隨機(jī)取10個(gè)桃果，處理后每隔2 d記錄桃果腐爛個(gè)數(shù)，計(jì)算桃果腐爛率，每個(gè)桃果重復(fù)三次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并制圖，誤差線表示數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)誤，采用Student t-test進(jìn)行差異比較并計(jì)算P值。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃果色澤變化

色差L*值反映從黑到白的光澤明亮度，采后不同處理的桃果色澤變化如圖 1[15]。在貯藏期內(nèi)，經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液、抗菌蛋白和多菌靈處理后的桃果色差L*值呈先上升后平穩(wěn)變化趨勢，而對照組桃果色差L*值在貯藏3 d后顯著下降。說明采后處理可較好保持貯藏期桃果原有色澤。貯藏11 d后，經(jīng)地衣芽孢桿菌 W10抗菌蛋白處理桃果色差 L*值為63.37，顯著高于對照組(56.12)，說明地衣芽孢桿菌W10抗菌蛋白處理可提高貯藏期桃果果面亮度。

圖1 不同處理后桃果色澤變化Fig.1 Changes of chromatic aberration of peach under different treatments

2.2 桃果硬度變化

硬度是影響桃果口感的重要因素，采后不同處理對桃果硬度影響如圖 2。隨著貯藏天數(shù)增加，桃果硬度顯著下降，說明桃果采后有一個(gè)自然軟化過程。貯藏5 d后，經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液、抗菌蛋白處理的桃果硬度分別為 2.049 kg·cm-2和1.917 kg·cm-2，顯著高于對照組(1.166 kg·cm-2)以及多菌靈處理(0.681 kg·cm-2)(P<0.05)，但地衣芽孢桿菌 W10菌液和抗菌蛋白處理桃果硬度差異不顯著(P>0.05)。貯藏至11 d，采后處理桃果硬度與對照組無差異。因此，桃果采后經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液和抗菌蛋白處理前期可延緩果肉硬度變化。

圖2 不同處理后果實(shí)硬度變化Fig.2 Changes of firmness of peach under different treatments

2.3 桃果可溶性固形物含量變化

采后不同處理對桃果可溶性固形物含量影響如圖 3。貯藏期內(nèi)，桃果可溶性固形物含量變化呈平穩(wěn)上升趨勢。貯藏 11 d后，經(jīng)地衣芽孢桿菌 W10菌液和抗菌蛋白處理桃果可溶性性固形物含量分別為11.43%和11.13%，二者之間差異不顯著，但皆顯著高于對照組(10.14%)及多菌靈處理桃果(10.11%)。說明地衣芽孢桿菌W10菌液和抗菌蛋白處理采后桃果可在一定程度上增加桃果可溶性固形物含量[16]。

圖3 不同處理后桃果可溶性固形物含量變化Fig.3 Changes of soluble solid content of peach under different treatments

2.4 桃果失重率變化

采后不同處理對桃果失重率變化影響如圖4所示。貯藏至11 d，經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液和抗菌蛋白處理的桃果失重率分別為13.89%和14.43%，顯著(P<0.05)低于對照組(19.79%)和經(jīng)多菌靈處理桃果(17.46%)。說明采后桃果經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液和抗菌蛋白處理可有效抑制桃果實(shí)采后失重，且抑制作用優(yōu)于經(jīng)多菌靈處理組。

圖4 不同處理后桃果失重率變化Fig.4 Changes of weight loss of peach under different treatments

2.5 桃果腐爛率變化

采后不同處理對桃果腐爛率變化影響如圖5所示。貯藏期桃果均有不同程度腐爛，貯藏至11 d，經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液和抗菌蛋白處理的桃果實(shí)腐爛率分別為20.00%和23.33%，都顯著(P<0.05)低于對照組(31.67%)。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌W10菌液處理的桃果實(shí)腐爛率(20.00%)與多菌靈處理的桃果腐爛率(16.67%)差異不顯著(P>0.05)。由此說明，地衣芽孢桿菌W10菌液和抗菌蛋白處理均可抑制貯藏期桃果腐爛。

圖5 不同處理后桃果腐爛率變化Fig.5 Changes of rotting rate of peach under different treatments

3 討論

芽孢桿菌作為生防細(xì)菌具有繁殖速度快，營養(yǎng)要求簡單，易于在植物體表繁殖等優(yōu)點(diǎn)。目前，在采后桃果保鮮研究應(yīng)用中主要涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)?？莶菅挎邨U菌 CPA-8能有效防治桃褐腐病，其產(chǎn)生的脂肽類抗菌物質(zhì)Fengycin具有重要的防腐作用[17]。解淀粉芽孢桿菌C06對采后桃褐腐病防效高達(dá) 78%，可將桃果的貨架期從 3 d延長至 7 d，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)為脂肽類化合物Fengycin和Bacillomycin D[18]。地衣芽孢桿菌W10是本實(shí)驗(yàn)室從植物根際土壤中分離篩選出來的一株高效生防菌，具有廣譜抗菌性，對桃褐腐病、桃枝枯病均具有抑菌效果。相比于脂肽類抗菌物質(zhì)，本研究首次明確地衣芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的抗菌蛋白在桃果保鮮中的作用，為該類抗菌蛋白的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

影響采后桃果貯藏期品質(zhì)的不僅是外觀色澤變化，還包括果實(shí)硬度、可溶性固形物含量等多項(xiàng)內(nèi)在指標(biāo)[19]。與對照組相比，經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液及抗菌蛋白處理后桃果色澤、果實(shí)硬度和可溶性固形物含量均有所提高，且對貯藏期桃果采后失重有所抑制，說明用地衣芽孢桿菌W10菌液和抗菌蛋白處理采后桃果對保持其原有品質(zhì)具積極作用[20]。貯藏期間桃果腐爛率較高，經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液和抗菌蛋白處理可顯著降低果實(shí)腐爛率[21]。貯藏至11 d時(shí)，經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液處理桃果腐爛率降低至20%，與化學(xué)藥劑多菌靈防腐效果差異不顯著。說明地衣芽孢桿菌W10可達(dá)到與化學(xué)藥劑相當(dāng)?shù)姆栏Ч?，且其保鮮效果優(yōu)于化學(xué)藥劑。經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌W10抗菌蛋白的有效抑菌成分是分子量為48794.16 Da的絲氨酸蛋白酶，具有水溶特性[22]。經(jīng)地衣芽孢桿菌W10菌液和抗菌蛋白處理后的桃果用清水沖洗即無殘留，保證了桃果食用的安全性。地衣芽孢桿菌W10抗菌蛋白無色無味，不影響果實(shí)風(fēng)味，作為原材料在生物保鮮劑領(lǐng)域具有廣闊的市場應(yīng)用前景[23]。