成亞琳 趙怡心 張任飛 劉宏*

1. 綿陽市第三人民醫(yī)院/四川省精神衛(wèi)生中心，四川 綿陽 621000 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖健康與不孕癥中心，重慶 400016

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的高發(fā)生率、嚴(yán)重并發(fā)癥成為困擾人們的公共衛(wèi)生難題，其骨吸收超過骨形成，骨密度降低，骨組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞，骨骼變得脆弱，易于發(fā)生骨折[1]。長期以來，人們認(rèn)為PMOP的發(fā)生與絕經(jīng)后雌激素水平降低有關(guān)[2]，但隨著研究[3]進(jìn)展，也有人認(rèn)為圍絕經(jīng)期顯著升高的促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)是引起PMOP的重要原因之一。

FSH是來源于腺垂體的促性腺激素[4]，由特異性的β亞基通過非共價鍵連接非特異性的α亞基[5-7]組成二聚體，與卵巢或睪丸中的FSH受體(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)結(jié)合[8]調(diào)節(jié)性腺發(fā)育[4]，其分泌受下丘腦、卵巢或睪丸等的調(diào)節(jié)。長久以來，人們對FSH生理作用的認(rèn)識局限于生殖系統(tǒng)，但隨著研究方法的多樣化，人們也開始關(guān)注其對生殖系統(tǒng)以外的影響[9]。

研究表明，F(xiàn)SHR廣泛分布于多種組織。胰腺[10]、前列腺[11]、胎盤[12]等均有FSH和FSHR存在，血糖[10]、血脂[13]調(diào)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移[14]、血管形成[12]等也有其參與。骨骼系統(tǒng)中，破骨細(xì)胞及其前體、成骨細(xì)胞前體[15]以及軟骨細(xì)胞[16]上均檢測到FSHR表達(dá)。在破骨細(xì)胞及其前體上，F(xiàn)SH與Giα偶聯(lián)的FSHR結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，使骨吸收增加，因而認(rèn)為絕經(jīng)期升高的FSH是引起PMOP的原因之一[15]。Tourkova等[17]通過研究FSH對間充質(zhì)干細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)FSH可以增加MSCs的增值，但對成骨分化并無顯著影響，甚至隨著時間延長會減少骨形成。此外，也有研究表明，F(xiàn)SHβ能增強BMP/Smad通路[18]和Notch通路[19]協(xié)同BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化。那么，作為五大發(fā)育信號之一的Wnt通路是否也參與了FSH增強BMP9誘導(dǎo)的成骨分化呢？

Wnt信號龐大而復(fù)雜，最經(jīng)典的是Wnt/β-catenin信號[20]。Wnt配體與受體結(jié)合后，抑制APC-Axin-GSK3β復(fù)合物的功能，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin磷酸化水平降低，非磷酸化水平顯著升高，轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與TCF/LEF形成復(fù)合物，激活下游靶基因：cyclin D1、c-Myc、c-Jun、DPAGT1等的轉(zhuǎn)錄[21]，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活[22]。Wnt通路與多種信號網(wǎng)絡(luò)存在聯(lián)系，可通過β-catenin與Runx2相互作用，參與BMP9對MSCs的成骨調(diào)節(jié)[23]。因此，本課題在前期研究[18, 19]的基礎(chǔ)上探討了Wnt/β-catenin信號對FSHβ協(xié)同BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的影響。

PMOP引起的健康問題受到廣泛關(guān)注，有人期待以絕經(jīng)期顯著升高的FSH為契機，尋找防治新方向。本課題使用從C3H小鼠胚胎中分離建立的具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞株C3H10T1/2為研究對象，以重組腺病毒為GFP、FSHβ和BMP9載體，將FSHβ與有較強成骨作用的BMP9相結(jié)合，探討FSHβ對BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨的影響，為絕經(jīng)后骨松的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究中使用的293T人胚腎細(xì)胞和C3H10T1/2細(xì)胞均從ATCC(American type culture collection)公司采購[19]。ALP顯色試劑盒從Beyotime Biotechnology公司采購。ARS染料從重慶賽米克生物科技有限公司采購。細(xì)胞總RNA快速抽提試劑盒(Trizol)為美國英杰(Invitrogen)公司生產(chǎn)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR檢測試劑盒從寶生物工程(大連)有限公司采購。XAV-939購買于MedChemExpress公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):本研究中所有細(xì)胞均在含90 %高糖、10 %熱滅活胎牛血清(fetal calf serum, FCS)和1 %鏈霉(100 μg/mL)-青霉素(100 U/mL)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置5 % CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2.2重組腺病毒GFP、BMP9和FSHβ的構(gòu)建與擴增:本研究使用的目標(biāo)重組腺病毒GFP、BMP9和FSHβ(Ad-GFP、Ad-BMP9和Ad-FSHβ)均使用AdEasy系統(tǒng)[24]構(gòu)建，表達(dá)綠色熒光，293T細(xì)胞擴增后凍存于-80 ℃。

1.2.3目標(biāo)腺病毒滴度測定及藥物濃度測定:本研究設(shè)計為四組：Ad-GFP組(對照組)、Ad-BMP9組、Ad-FSHβ組和Ad-BMP9+Ad-FSHβ組(后三組為實驗組)。將C3H10T1/2細(xì)胞消化、離心、重懸后以適當(dāng)密度接種于24孔板[19]，待細(xì)胞貼壁后，取適量重組腺病毒原液按倍比稀釋法感染細(xì)胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)各種腺病毒綠色熒光表達(dá)量，結(jié)合ALP顯色結(jié)果選擇重組腺病毒感染濃度進(jìn)行研究。此外，將不同濃度的XAV-939加入Ad-BMP9+Ad-FSHβ實驗組，根據(jù)ALP染色結(jié)果選擇藥物濃度。每組實驗重復(fù)次數(shù)：n=3。

1.2.4ALP染色:將細(xì)胞接種于24孔板，根據(jù)測定的腺病毒或藥物濃度處理細(xì)胞，7 d后按ALP顯色試劑盒操作說明對細(xì)胞進(jìn)行固定、清洗、染色、照相并記錄。每組實驗重復(fù)次數(shù)：n=3。

1.2.5目的基因檢測：將細(xì)胞接種于24孔板，重組腺病毒或藥物處理細(xì)胞，5 d后根據(jù)TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR檢測試劑盒使用說明提取細(xì)胞總RNA、合成cDNA并檢測目的基因表達(dá)。每組實驗重復(fù)次數(shù)：n=3。目的基因前、后引物序見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Gene primers sequences

1.2.6ARS染色：將細(xì)胞接種到24孔板，重組腺病毒感染細(xì)胞后第3天用含10 mmol/L β-磷酸甘油和50 ng/mL維生素C的鈣鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)基替代DMEM培養(yǎng)基，第28天移棄培養(yǎng)基后經(jīng)多聚甲醛(4 %)固定、茜素紅S染色后顯微鏡下采集圖像信息。每組實驗重復(fù)次數(shù)：n=3。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 FSHβ對BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化中堿性磷酸酶和鈣鹽小結(jié)的影響

ALP是一種糖蛋白，在骨組織中被認(rèn)為是骨形成的早期生物學(xué)標(biāo)志物[25]。另外，在MSCs向骨細(xì)胞分化的進(jìn)程中，成骨細(xì)胞是一個重要的中間分化形態(tài)，其重要的生物學(xué)特征是分泌細(xì)胞外基質(zhì)(類骨質(zhì))，導(dǎo)致磷酸鈣沉積，即礦化，茜素紅S染色后呈橘紅色。因此，鈣鹽小結(jié)被認(rèn)為是其重要的晚期標(biāo)志物之一。將測定滴度的目標(biāo)腺病毒按實驗設(shè)計感染C3H10T1/2細(xì)胞，分別于7 d和28 d后檢測ALP和鈣鹽小結(jié)的表達(dá)。研究結(jié)果如圖1 A所示，較Ad-GFP對照組，Ad-FSHβ實驗組ALP的顯色無明顯差異，Ad-BMP9實驗組明顯加深，提示FSHβ對MSCs向成骨細(xì)胞的分化無顯著影響，BMP9則有較強的成骨誘導(dǎo)功能；而Ad-BMP9與Ad-FSHβ聯(lián)合實驗組ALP顯色較Ad-BMP9實驗組進(jìn)一步加深，鈣鹽小結(jié)染色結(jié)果也呈現(xiàn)相似的顯色趨勢(圖1B)，提示 FSHβ表達(dá)增強了BMP9誘導(dǎo)下MSCs成骨方向分化的能力。

2.2 FSHβ對BMP9誘導(dǎo)的MSCs中cyclin D1 mRNA表達(dá)的影響

本課題前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的BMP/Smad信號[18]和Notch信號[19]可能參與了FSHβ協(xié)同BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨，因而，本研究探討了經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號是否也在其中發(fā)揮作用。檢測Wnt/β-catenin通路下游基因轉(zhuǎn)錄，在Ad-FSHβ實驗組，cyclin D1 mRNA的表達(dá)量與Ad-GFP對照組相比無顯著性差異， Ad-BMP9實驗組的表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，提示單獨用FSH處理MSCs不會引起Wnt/β-catenin信號的增強，而BMP9則可誘導(dǎo)經(jīng)典的Wnt信號傳遞；此外，聯(lián)合使用Ad-BMP9和Ad-FSHβ處理MSCs，cyclin D1的轉(zhuǎn)錄較Ad-BMP9實驗組顯著增加(P<0.01)，提示FSHβ增強了BMP9誘導(dǎo)的cyclin D1的轉(zhuǎn)錄(圖2)，亦即FSHβ增強了BMP9誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號傳遞。

圖1 FSHβ對BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化中ALP和鈣鹽小結(jié)的影響 A:ALP顯色結(jié)果顯示各組ALP表達(dá)情況(7 d)；B:ARS染色后光學(xué)顯微鏡下各組鈣鹽小結(jié)沉積情況(28 d，100×)。Fig.1 The influences of FSH on ALP and calcium salt nodules of MSCs osteogenesis differentiation induced by BMP9 A:ALP chromogenic reaction showed the ALP expression in all groups (7 days); B:ARS staining results showed the calcium salt nodules deposition in each group with optical microscope dectection (28 days, 100×).

圖2 qPCR技術(shù)檢測各組cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平(5 d，n=3，Student’s t-test)注：與Ad-GFP組比較，**P<0.01；與 Ad-BMP9組比較，&&P<0.01。Fig.2 qPCR technology assayed the transcription levels of cyclin D1 in each group(5 days, n=3, Student’s t-test)

2.3 XAV-939降低了FSHβ增強BMP9誘導(dǎo)的MSCs中cyclin D1轉(zhuǎn)錄和ALP表達(dá)

本研究使用Wnt信號抑制劑XAV-939進(jìn)一步驗證筆者的猜想。XAV-939可結(jié)合ADP-核糖基化酶催化域穩(wěn)定Axin，降低β-catenin穩(wěn)定性，因此在該通路中起阻滯劑功能。首先，本研究檢測了XAV-939處理后各研究組中Wnt/β-catenin下游基因的轉(zhuǎn)錄。和預(yù)期一樣(圖3)，XAV-939處理后，降低了細(xì)胞中BMP9誘導(dǎo)的cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)，也降低了Ad-BMP9與XAV-939聯(lián)合實驗組中cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，提示XAV-939降低了FSHβ增強BMP9誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，顯色實驗顯示各研究組中ALP的表達(dá)和cyclin D1轉(zhuǎn)錄有相似的變化，提示XAV-939抑制了FSHβ協(xié)同BMP9誘導(dǎo)成骨的作用。

3 討論

PMOP的高發(fā)生率已引起各國的重視，其病因、發(fā)病機制、診治方法、預(yù)防策略等都是廣泛關(guān)注的問題。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，具有成骨分化潛能的MSCs有望在PMOP的防治中發(fā)揮作用，但由于其多向分化特性，其在成骨中的實際應(yīng)用受到限制。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH除調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)外，對骨骼系統(tǒng)也存在影響。FSH對骨形成負(fù)調(diào)控，F(xiàn)SHβ亞基的多克隆抗體不僅阻斷FSH對破骨細(xì)胞的作用，還能刺激骨形成，增加成骨細(xì)胞數(shù)量[26]。但利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在雌鼠高表達(dá)FSH[27]卻能增加脛骨和椎體小梁骨體積；另外，不同的FSHR基因型(AA rs 6166和GG rs 6166)對骨代謝也可產(chǎn)生不同影響[28]。由此，F(xiàn)SH對骨骼系統(tǒng)影響復(fù)雜。PMOP表現(xiàn)為骨丟失超過骨形成，而破骨細(xì)胞前體和成骨細(xì)胞前體上均有FSHR存在，那么是否有因子能與之協(xié)作后逆轉(zhuǎn)FSH的破骨能力，向成骨方向發(fā)展，成為筆者的研究目標(biāo)。

很多因子都與FSH存在聯(lián)系，BMPs家族即是其中之一。BMP7能增加人卵巢顆粒細(xì)胞FSHR表達(dá)，調(diào)節(jié)卵泡成熟[29]；在未分化的顆粒細(xì)胞里，BMP2卻能誘導(dǎo)Smad1/5/8磷酸化阻斷FSH誘導(dǎo)的FSHR表達(dá)，從而抑制FSH應(yīng)答[30]。BMP9被證實有較強誘導(dǎo)成骨分化的作用[31]，本課題推測FSH也能調(diào)節(jié)BMP9誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化。

圖3 XAV-939(1 μmol/L)處理后各組中cyclin D1 mRNA和ALP的表達(dá)檢測 A：qPCR檢測各組中cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄(5 d，n=3，Student’s t-test。與Ad-GFP組相比，**P<0.01；與Ad-BMP9組相比， ##P<0.01；與Ad-BMP9組相比，&&P<0.01；與AdBMP9+Ad-FSHβ組相比，@P<0.05)；B：ALP顯色實驗檢測各組ALP的表達(dá)(7 d)。Fig.3 The expressions detection of cyclin D1 mRNA and ALP in all groups with XAV-939 (1 μmol/L) treatment

研究以C3H10T1/2為間充質(zhì)干細(xì)胞代表，用重組腺病毒攜帶BMP9和FSHβ基因體外表達(dá)驗證筆者的猜想。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SH能增強BMP9成骨誘導(dǎo)效應(yīng)，表現(xiàn)為BMP9與FSHβ共同實驗組ALP、鈣鹽小結(jié)表達(dá)比BMP9實驗組更高，這與本課題前期研究相符[18-19]。另外，前期研究也證實BMP/Smad信號[18]和Notch信號[19]參與了此過程。因此，本研究接下來檢測了Wnt/β-catenin通路的變化。利用qPCR技術(shù)檢測到FSHβ增加了BMP9誘導(dǎo)的cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平，而單獨的FSH作用對其并無影響，在使用通路抑制劑XAV-939的情況下該作用受到部分抑制，表現(xiàn)為BMP9、FSHβ與XAV-939共同實驗組cyclin D1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平降低，這種改變在ALP檢測中也得到相似的變化趨勢，因此反向驗證當(dāng)兩種因子共同作用也增加了Wnt/β-catenin的傳遞。

因此，本研究結(jié)果提示BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化可受到FSHβ亞基的增強，Wnt/β-catenin通路可能參與其中。然而，其中涉及的具體作用機制仍需進(jìn)一步深入研究。另外，結(jié)合本課題的早期研究，三種信號通路以外是否還有其他的信號參與，以及三者之間是否有相互聯(lián)系都是本課題接下來的研究內(nèi)容，以期為絕經(jīng)后骨病的防治提供合理的依據(jù)。

致謝：感謝重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院骨發(fā)育與再生平臺為本研究提供的技術(shù)支持與幫助。