李晶峰 李春楠 楊小倩 郅慧 王亞平 張輝 孫佳明

長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見疾病，其特征是骨密度(bone mineral density，BMD)普遍降低，骨組織微結構惡化，骨折風險增加。龜甲是中醫(yī)臨床常用的抗骨質疏松藥物，具有滋養(yǎng)腎陰之功效，可生髓益腎強骨，固經(jīng)止血，補心安神。龜甲對糖皮質激素性骨質疏松大鼠腰椎、脛骨骨密度和骨強度均有改善作用[1]，龜甲能夠使糖尿病性骨質疏松患者骨密度顯著上升[2]，但對于龜甲治療骨質疏松的藥效物質基礎與機制報道卻很少。因此，分析龜甲的活性成分、作用靶點及其可能作用的機制有利于闡述龜甲的科學內涵，并促進其臨床應用。

網(wǎng)絡藥理學通過構建“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡，揭示多種化合物協(xié)同作用于人體的機制。中藥及其復方藥味較多，化學成分復雜，往往具有藥效分散、靶向眾多的特點。而正是由于多靶向作用原理，彌補了中藥復方針對單靶點藥效不強的缺陷，表現(xiàn)出整體治療、協(xié)同調理并舉的特色，體現(xiàn)了中藥“物質基礎-藥性-藥效”的關系特點[3]。

本研究通過對龜甲成分與骨質疏松靶點進行對比，篩選龜甲中治療骨質疏松有效成分及相關靶點，通過KEGG通路分析，合理推斷龜甲治療骨質疏松作用機制，為龜甲的現(xiàn)代藥理學研究提供參考，也為其他中藥的相關研究提供借鑒。

1 數(shù)據(jù)庫

BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫、 TTD數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫。

2 方法

2.1 龜甲化學成分的收集

本研究綜合BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫及文獻調研，構建了龜甲化學成分數(shù)據(jù)庫。經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢與文獻檢索共得到40個化合物[4-7]。

2.2 龜甲化學成分靶點的獲得

龜甲化學成分靶點從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得，數(shù)據(jù)庫沒有靶點的化學成分，利用SwissTarget Prediction，得到化合物靶點，將靶點通過Uniprot網(wǎng)站標準化為Uniprot ID。

2.3 骨質疏松靶點的獲得

在TTD數(shù)據(jù)庫、Drugbank 數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中輸入“Osteoporosis”，得到骨質疏松疾病的靶點，靶點標準化為Uniprot ID。

2.4 通路富集分析

基因本體論(gene ontology，GO)是用于描述基因產(chǎn)物功能并廣泛應用的一個本體，它能夠在基因組規(guī)模下和不同物種之間對給定基因集進行功能注釋。京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，用于從分子水平信息了解細胞、生物體和生態(tài)系統(tǒng)等生物系統(tǒng)。本研究采用在線分析工具Metascape，對龜甲活性化學成分靶基因KEGG富集分析、龜甲治療骨質疏松靶基因進行GO、KEGG富集分析[8]。

3 結果

3.1 龜甲活性成分

數(shù)據(jù)庫與文獻共收集龜甲活性成分40個，其中包括氨基酸、脂肪酸、酯類、甾醇類、其他類，見表1。

表1 龜甲活性成分的主要信息

3.2 龜甲活性成分靶基因KEGG通路富集分析

龜甲成分通過數(shù)據(jù)庫共收集530個靶基因，利用Metascape對龜甲活性成分靶基因進行KEGG富集分析。P值排名前20的KEGG代謝通路在圖1 A中表示，聚類網(wǎng)絡樹見圖1B。

圖1 龜甲活性成分靶基因KEGG富集分析圖 A：富集項熱圖；B：富集項網(wǎng)絡圖。Fig.1 KEGG enrichment of active components in tortoise shell A: Heat map of enriched; B: Network of enriched termsterms.

龜甲活性化合物關鍵靶點的KEGG富集分析如表2所示，這些基因主要與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、氨酰- tRNA生物合成、谷氨酸能突觸等信號通路相關。

3.3 龜甲治療骨質疏松靶基因功能與通路富集分析

3.3.1龜甲抗骨質疏松靶基因對應化合物分析：龜甲成分篩選出530個靶基因，骨質疏松篩選出84個靶基因，骨質疏松與龜甲成分交集共15個基因：UGT2B17、PTGS2、SLC22A6、SLC22A10、PTGER2、SRC、COMT、TNF、ESR1、CYP19A1、ESR2、AR、PGR、ITGB3、FDPS。這些靶點對應的化合物有脂肪酸類6個、氨基酸類4個、甾醇類5個、其他類2個，見表3。

3.3.2龜甲抗骨質疏松靶點-功能相關蛋白網(wǎng)絡拓撲參數(shù)分析：分析蛋白質相互作用網(wǎng)絡的拓撲特性，不僅有助于研究未知蛋白質的生物學功能，也為進一步研究蛋白質之間如何通過相互作用來完成生命活動提供理論依據(jù)。蛋白質節(jié)點自由度越大則表明其參與的生物功能越多，其生物學重要性越強；平均最短路徑長度越小說明蛋白越重要。節(jié)點距離其他節(jié)點越近，則接近中心性越大[9]。應用Network Analyzer得到15個靶點的相關拓撲數(shù)據(jù)，排名前7位的PTGER2(EP2)，ITGB3，PGR，SRC，F(xiàn)DPS，COMT，TNF為龜甲治療骨質疏松的關鍵靶點，如表4所示為關鍵靶點相關拓撲參數(shù)。前列腺素(prostaglandins，PG)在調節(jié)骨對機械刺激反應中起重要作用。前列腺素E2(PGE2)是骨代謝的有效調節(jié)因子。PGE2對骨的影響是通過四種受體(EP1、EP2、EP3和EP4)介導的。EP2受體對小鼠骨骼生物力學性能的影響較大，EP2受體缺失導致小鼠骨生物力學強度降低[10]。破骨細胞的激活會導致破骨細胞特異基因ITGB3的表達[11]。 SCR在骨代謝中發(fā)揮重要作用，SCR家族酪氨酸激酶參與礦物形成[12]；血小板衍生生長因子BB在人成骨細胞分化和增殖中起著重要作用，血小板衍生生長因子BB還上調成骨相關基因的表達，促進礦物質結節(jié)的形成，SCR參與這些過程[13]。兒茶酚-O-甲基轉移酶(catechol-o-methyltransferase，COMT)多態(tài)性可以改變骨微環(huán)境和/或循環(huán)中的雌激素狀態(tài)，從而調節(jié)身體活動與骨參數(shù)之間的關聯(lián)[14]。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)DPS)與氨基雙膦酸鹽治療后的骨密度和骨轉換標志物的變化有關[15-16]。骨代謝涉及骨保護素(OPG)及其配體在內的腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，OPG是TNF受體超家族的細胞因子，TNF-α和Il-1β可升高OPG水平[17]。

表2 龜甲活性成分靶基因KEGG富集分析Table 2 KEGG enrichment of active components in tortoise shell

表3 龜甲抗骨質疏松15個靶點對應的化合物

圖2 龜甲抗骨質疏松靶基因的GO富集分析 A：GO富集項熱圖；B：GO富集項網(wǎng)絡圖。Fig.2 GO enrichment of the target gene of tortoise shell anti osteoporosis A: Heat map of enriched terms across input gene lists; B: Network of GO enriched terms.

3.3.3龜甲抗骨質疏松靶基因GO通路富集分析：龜甲抗骨質疏松靶基因共15個，基于Metascape平臺進行GO富集分析，GO富集項見圖2。龜甲抗骨質疏松靶基因GO富集分析見表5，主要與對類固醇激素的反應、上皮細胞增殖的調控、脂質定位的調節(jié)等相關。類固醇激素是一類具有神經(jīng)活性的甾體激素，由腎上腺皮質分泌，臨床應用廣泛，但長期使用會產(chǎn)生骨質疏松癥[18]；絕經(jīng)后骨質疏松癥患者血清高密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇水平較高[19]；糖皮質激素性骨質疏松是一種藥物性繼發(fā)性骨質疏松，主要由骨形成抑制引起，與成骨細胞的增殖和功能密切相關[20]。

表4 龜甲治療骨質疏松靶基因的拓撲參數(shù)

3.3.4龜甲抗骨質疏松靶基因KEGG通路富集分析：利用Metascape在線工具對龜甲抗骨質疏松15個靶基因進行KEGG富集分析，P值排名前3的KEGG代謝通路見圖3。結果表明,這些基因主要與類固醇激素生物合成、甲狀腺素信號途徑、癌癥的途徑信號通路相關，分析見表6。雌激素是一種類固醇激素，雌激素水平的降低可導致骨質疏松[21]。 Xia T[22]的研究表明熟地黃提取物主要通過干預類固醇激素的生物合成來預防糖皮質激素引起的骨質疏松。Arnautovic-Halimic A[23]評價絕經(jīng)后正常甲狀腺婦女骨質丟失早期和晚期甲狀腺素水平及骨密度比值，患有骨質疏松癥的患者組和保留骨量的患者組的促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)和游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)的平均水平?jīng)]有顯著差異，而患有骨質疏松癥的血清婦女的游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)的平均水平與對照組相比在統(tǒng)計學上顯著降低，甲狀腺素(TSH)狀態(tài)的生理變化可能是骨質疏松癥發(fā)生的早期指標。Kim等[24]證明在健康的甲狀腺功能正常的婦女中，TSH值與低礦物質骨密度有關。在某些絕經(jīng)后婦女中，骨質疏松癥已被認為是雌激素受體陽性乳腺癌治療的晚期效應[25]。RANKL是腫瘤壞死因子(TNF)家族的一員，RANKL上調時會促進破骨細胞分化，并導致過度的骨吸收，從而導致骨完整性喪失[26]。RANKL同時參與了乳腺腫瘤的發(fā)生，在RANK和RANKL受體缺陷小鼠的研究中，哺乳期的乳腺沒有發(fā)展為癌癥[27]。在另一項研究[28]中，小鼠乳腺癌變的發(fā)展與RANKL表達增加有關，并且加速RANK轉基因小鼠乳腺癌變。前列腺癌患者因癌癥治療會引起骨質流失并存在骨折的危險，并面臨著病理性骨折、嚴重骨痛和其他骨轉移后遺癥的風險[29]。

圖3 龜甲抗骨質疏松靶基因的KEGG富集分析Fig.3 Key target pathway enrichment analysis of tortoise shell for osteoporosis

表5 龜甲治療骨質疏松靶基因GO功能富集分析Table 5 GO network enrichment analysis of key network targets of tortoise shell for osteoporosis

表6 龜甲治療骨質疏松靶基因KEGG富集分析Table 6 Key target pathway enrichment analysis of tortoise shell for osteoporosis

3.3.5龜甲-成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖:利用Cytoscape軟件建立了龜甲11種活性化合物、15個靶基因與3條通路之間的龜甲-成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖，如圖4所示。

圖4 龜甲-成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖注：代表龜甲，代表成分，代表靶點，代表通路。Fig.4 network of tortoise shell-component-target-pathway

4 討論

OP是一種骨代謝疾病，臨床表現(xiàn)主要為骨結構異常、骨脆性增高和骨量減少，易出現(xiàn)骨折，嚴重影響患者的生活質量[30]。龜甲具有滋陰潛陽、益腎強骨之功效，可促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化[31]，并對骨質疏松有較好的治療效果[32]，符合“腎主骨，生髓”的中醫(yī)基礎理論，可作為補腎類治療OP的中藥。

龜甲中主要含有氨基酸、脂肪酸等成分，Su Y等[33]分析的1 424名男性和1 573名女性(平均年齡72歲)中，血清纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和色氨酸濃度與髖部骨密度有關，血清總同型半胱氨酸濃度與骨密度相關，較高的血清色氨酸濃度有可能降低發(fā)生骨質疏松性骨折的風險，男性血清中同型半胱氨酸的含量與骨質疏松性骨折相關；骨骼攝取的脂肪酸很可能被加工以生成ATP，因為體內骨從頭合成脂質的測量值較低，血清脂蛋白對正常成骨細胞增殖是必需的[34]，成骨細胞可以氧化脂肪酸，脂肪酸氧化產(chǎn)生的能量能夠促進骨形成[35]，隨著成骨細胞體外成熟，脂肪酸氧化顯著增加[36]；碳酸鈣能提高骨質疏松大鼠的抗氧化能力，增加骨密度，提高血清鈣水平，減少骨礦流失，從而防治骨質疏松癥[37]。

將宏觀藥效與微觀藥物分子機制有機結合，在中醫(yī)理論要求的整體層面上對龜甲單味藥與機體的交互作用進行分析，同時聯(lián)系現(xiàn)代醫(yī)學“基因-疾病-藥物”研究模式進行新的藥物靶點、作用通路預測極具意義。本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法初步探討了龜甲活性成分、相關靶點、龜甲治療骨質疏松靶點及其相關通路，構建了龜甲-成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖。預測了龜甲治療骨質疏松的相應靶點及通路，涉及類固醇激素、甲狀腺素、癌癥等多個環(huán)節(jié)，各通路間通過共有靶點連接，闡明龜甲不同成分間的多靶點、多途徑的協(xié)同作用。