趙悅辰,郭 杰,李云峰,邱 玲,孫 婧,周劍烽,王鐵君

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 腫瘤放療科，吉林 長(zhǎng)春130041)

宮頸癌是全球女性最常見(jiàn)的癌癥之一，也是女性癌癥高死亡率的原因之一。近年來(lái)，隨著放療技術(shù)的進(jìn)步，同步放化療已成為局部中晚期宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[1,2]。然而，局部中晚期宮頸癌放療后仍有約30%-40%發(fā)生局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、惡性加重等[3,4]。這可能與腫瘤在放療期間產(chǎn)生放射抗性有關(guān)，放射抗性的產(chǎn)生是臨床腫瘤放療的主要障礙。因此，提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，尋找高效的腫瘤放療增敏藥物是宮頸惡性腫瘤放射治療的關(guān)鍵[5]。

莪術(shù)油為莪術(shù)蒸餾所得的揮發(fā)油，為中藥莪術(shù)的主要有效成分。既往研究證實(shí)莪術(shù)油有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，可直接抑制、破壞腫瘤細(xì)胞，還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫作用[6,7]。但對(duì)于莪術(shù)油的放射增敏作用的研究尚屬空白。本研究欲探究莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，用含有10%胎牛血清、1%抗生素-抗有絲分裂溶液的MEM培養(yǎng)基，在濕度為95%、37℃、含5%CO2條件下培養(yǎng)。每2天換一次液，細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2 照射條件

使用X射線生物輻照儀以1.020 Gy/min(180 kV；20 mA)的劑量率進(jìn)行照射，靶皮距70 cm。根據(jù)設(shè)立各組別不同，給予不同照射劑量。

1.3 CCK-8法

1.3.1檢測(cè)不同濃度莪術(shù)油注射液對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

將 2×104/ml細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μl，貼壁生長(zhǎng)后給予10-50 μg/ml濃度莪術(shù)油與MEM培養(yǎng)基預(yù)混液處理，每種濃度平行 3 孔，設(shè)立空白對(duì)照。各組分別在加藥后 24、48 h后棄上清后，每孔加入 100 μl CCK-8試劑與MEM培養(yǎng)基1∶9配制的預(yù)混液，繼續(xù)孵育 4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm 波長(zhǎng)下各組吸光度，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。

1.3.2檢測(cè)莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用

將5×104/ml細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μl。設(shè)立空白組，單藥組、6Gy照射組、10Gy照射組、藥物+6Gy照射組、藥物+10Gy照射組。貼壁生長(zhǎng)后，單藥組、藥物+6Gy照射組、藥物+10Gy照射組給予30 μg/ml濃度莪術(shù)油注射液與MEM培養(yǎng)基預(yù)混液處理，其他組給予MEM培養(yǎng)基，每孔100 μl，每組設(shè)3平行樣。孵育24 h后，6Gy照射組、藥物+6Gy照射組給予6Gy X線照射，10Gy照射組、藥物+10Gy照射組給予10Gy X線照射，照射條件如上所述。繼續(xù)孵育24 h后，各組棄上清液，每孔加入100 μl CCK-8試劑與MEM培養(yǎng)基1∶9配制的預(yù)混液，孵育 4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm 波長(zhǎng)下各組吸光度，計(jì)算抑制率。

1.4 流式細(xì)胞分析

設(shè)立空白組，單藥組、6Gy照射組、10Gy照射組、藥物+6Gy照射組、藥物+10Gy照射組。貼壁生長(zhǎng)后，單藥組、藥物+6Gy照射組、藥物+10Gy照射組給予30 μg/ml濃度莪術(shù)油注射液與MEM培養(yǎng)基預(yù)混液進(jìn)行培養(yǎng)，其他組給予MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。孵育24 h后，6Gy照射組、藥物+6Gy照射組給予6Gy X線照射，10Gy照射組、藥物+10Gy照射組給予10Gy X線照射，照射條件如上所述。繼續(xù)孵育24 h后，吸去培養(yǎng)液，無(wú)EDTA胰酶消化6 min后，加原培養(yǎng)液終止消化。各組細(xì)胞2 000 r·min-1，4℃條件下離心5 min，棄上清，加入 1 ml冷的 PBS，清洗細(xì)胞2次，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，2 000 r·min-1，4℃離心5 min。加入1 ml Buffer使細(xì)胞重懸，計(jì)數(shù)，稀釋至1×106個(gè)/ml。各組取100 μl體積細(xì)胞懸液，加入流式管中，每管分別加入2 μl PI和2 μl FITC染液輕輕混勻，避光室溫反應(yīng) 15 min。加入 200 μl Buffer，1 h 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測(cè)不同濃度莪術(shù)油注射液對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

分別給予濃度為10，20，30，40，50 μg·ml-1的莪術(shù)油注射液，作用24 h、48 h后Hela細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制(P<0.05)，且細(xì)胞抑制率與藥物濃度相關(guān)(P<0.05)，呈劑量依賴關(guān)系(表1，圖1)。

表1 CCK-8法檢測(cè)不同濃度莪術(shù)油注射液對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

圖1A 不同濃度莪術(shù)油作用24 h后細(xì)胞相對(duì)活力 圖1B 不同濃度莪術(shù)油作用48 h后細(xì)胞相對(duì)活力

2.2 CCK-8法檢測(cè)莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

與空白對(duì)照組相比，單藥組、6Gy照射組、10Gy照射組、藥物+6Gy照射組、藥物+10Gy照射組細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制(P<0.05)。表2、圖2中，與6Gy照射組相比，藥物+6Gy照射組細(xì)胞抑制率升高(P<0.05)；與10Gy照射組相比，藥物+10Gy照射組細(xì)胞抑制率顯著升高(P<0.05)。表明在莪術(shù)油的作用下，宮頸癌Hela細(xì)胞的放射敏感性增強(qiáng)。表2中，藥物+6Gy照射組細(xì)胞抑制率高于10Gy照射組(P<0.05)，表明在莪術(shù)油作用后使Hela細(xì)胞在6Gy照射條件下的增殖抑制率高于單獨(dú)10Gy照射。

圖2 莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用

表2 CCK-8法檢測(cè)莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖3。與空白組對(duì)照相比，各組處理后Hela細(xì)胞凋亡率不同程度增加(P<0.05)。其中，與6Gy照射組相比，藥物+6Gy照射組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與10Gy照射組相比，藥物+10Gy照射組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。以上可見(jiàn)，在莪術(shù)油的作用下，經(jīng)過(guò)電離輻射后的宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡率顯著升高，再次證明莪術(shù)油的放射增敏作用。表3、圖4中，藥物+6Gy照射組細(xì)胞凋亡率高于10Gy照射組(P<0.05)，表明在莪術(shù)油作用后使Hela細(xì)胞在6Gy照射條件下的凋亡率高于單獨(dú)10Gy照射。

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

圖4 莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

宮頸癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，因發(fā)病率與病死率持續(xù)攀升而備受關(guān)注。對(duì)于局部晚期宮頸癌患者，標(biāo)準(zhǔn)治療方法是同步放化療[8]。然而，宮頸癌細(xì)胞輻射抗性轉(zhuǎn)歸危像是嚴(yán)重制約病人預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，放療后局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，嚴(yán)重影響臨床療效[2,9]。此外，宮頸癌放療后常伴發(fā)膀胱、直腸等器官毒副反應(yīng)，放射性膀胱炎、放射性腸炎等嚴(yán)重影響放療患者的生存質(zhì)量[10]。因此，如何最大程度殺死腫瘤細(xì)胞，提高腫瘤的控制率，同時(shí)使腫瘤周圍正常組織傷害降到最低，降低正常組織器官放療毒性反應(yīng)，是目前宮頸癌放射治療領(lǐng)域亟待解決的難題。

放射增敏劑可通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、加速DNA損傷、產(chǎn)生自由基等方式來(lái)增強(qiáng)射線對(duì)腫瘤組織的損傷，從而提高放療療效[5]。目前臨床上常用的放療增敏藥物主要為細(xì)胞毒性化療藥物，中藥制劑合成的放療增敏藥物并不多見(jiàn)[11]。莪術(shù)油是姜科植物根莖中提取的揮發(fā)油，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)功效，其抗腫瘤作用近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)。過(guò)去的研究表明莪術(shù)油對(duì)多種惡性腫瘤有較好的殺傷作用，尤其是宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等婦科惡性腫瘤[12,13]。而關(guān)于莪術(shù)油的放射增敏作用目前研究較少，莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的影響的研究目前未見(jiàn)報(bào)道。

在本研究中，我們首先采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度莪術(shù)油注射液對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞抑制率與藥物濃度相關(guān)，呈劑量依賴關(guān)系。隨后，我們?cè)O(shè)立空白對(duì)照組、單藥組、6Gy照射組、藥物+6Gy照射組、10Gy照射組、藥物+10Gy照射組，通過(guò)CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)莪術(shù)油聯(lián)合放療對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用。我們發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)照射相比，莪術(shù)油聯(lián)合X線照射可使Hela細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著升高。值得注意的是，藥物+6Gy照射組Hela細(xì)胞抑制率、凋亡率高于10Gy照射組，表明經(jīng)過(guò)莪術(shù)油處理有效提升了放射線對(duì)腫瘤的殺傷作用，在低劑量照射條件下獲得優(yōu)于高劑量照射的效果。在臨床放射治療中，我們可通過(guò)使用莪術(shù)油等放療增敏藥物增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性，獲得與大劑量照射相同的治療效果，從而減少腫瘤靶區(qū)照射劑量，對(duì)于治療耐受性較差患者、宮頸癌復(fù)發(fā)患者等，具有指導(dǎo)意義。

綜上，本研究的結(jié)果顯示，莪術(shù)油聯(lián)合放療可顯著增加宮頸癌Hela細(xì)胞抑制率及凋亡率，在體外對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞有較好的放療增敏作用。因此，莪術(shù)油可作為一種新型的放療增敏劑，增加輻射抗性腫瘤的放療敏感性，或降低正常組織的受照劑量，擁有巨大的臨床應(yīng)用前景。然而，鑒于目前關(guān)于莪術(shù)油放射增敏作用的研究還不夠多，其在體內(nèi)的作用機(jī)制還不明確，更多的研究有待于開(kāi)展。