熊 苗，包春玲，周芳芳

(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院 婦產(chǎn)科，上海200123)

胚胎作為母體半同種異體組織抗原未被母體排斥而能成功存活，與母體妊娠免疫耐受有關(guān)。近年來(lái)研究顯示，妊娠免疫耐受紊亂在原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)中發(fā)揮至關(guān)重要作用[1]。FTY720是一種從冬蟲(chóng)夏草中提取的多球殼菌素經(jīng)化學(xué)修飾后的合成物，具有獨(dú)特藥理活性，能作用于淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，并與其他免疫抑制藥物具有協(xié)同作用，在自身免疫性疾病動(dòng)物模型及器官移植中具有良好應(yīng)用前景[2，3]。FTY720作為1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)受體激動(dòng)劑，通過(guò)拮抗S1P與受體結(jié)合，影響T細(xì)胞分化及功能，參與介導(dǎo)免疫耐受。鑒于FTY720的免疫抑制作用，本課題組前期采用FTY720干預(yù)自然流產(chǎn)孕鼠后能顯著降低孕鼠胚胎丟失率，但其具體機(jī)制尚不明確[4]。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受及維持免疫應(yīng)答等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，F(xiàn)TY720對(duì)DC細(xì)胞的毒性和吞噬性無(wú)明顯影響，但對(duì)其表面趨化因子及其受體分泌具有下調(diào)作用[5]。本研究以自然流產(chǎn)孕鼠為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建S1P-siRNA及過(guò)表達(dá)S1P慢病毒載體轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞，探討過(guò)繼轉(zhuǎn)移兩種慢病毒載體前后FTY720對(duì)DC的影響，旨在為臨床治療URSA提供新的治療靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性CBA/J小鼠、雄性DBA/2小鼠和雄性Balb/c小鼠，均為SPF級(jí)，6-8周齡，原種購(gòu)自日本國(guó)立遺傳研究所，后由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心遺傳室保種留存，經(jīng)檢驗(yàn)遺傳質(zhì)量檢測(cè)符合本品系國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。于本實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。本研究經(jīng)上海市第六人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，給予動(dòng)物人道主義關(guān)懷，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合3R原則。

1.2 主要試劑和儀器

FTY 720(上海嘉遠(yuǎn)生物科技有限公司)；S1P過(guò)表達(dá)和S1P-siRNA慢病毒載體(上海衛(wèi)藍(lán)海洋材料科技有限公司)；趨化因子受體CCR7、CCL19多抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗小鼠CD80、CD40、CD86、MHCII單抗以及IgG同型對(duì)照(美國(guó)Biolegend公司)；rmGM-CSF、mIL-4(美國(guó)Gibco公司)；流式細(xì)胞儀及分CD1a磁珠抗體(美國(guó)BD公司)。

1.3 方法

1.3.1轉(zhuǎn)染DC

DBA/2雄鼠骨髓來(lái)源DC分離、培養(yǎng)及鑒定，具體方法同前期研究工作[6-8]；轉(zhuǎn)染S1P過(guò)表達(dá)慢病毒載體、S1P-siRNA慢病毒載體的DC結(jié)果及鑒定見(jiàn)前期研究[4]。

1.3.2動(dòng)物建模及分組

雌性CBA/J小鼠和雄性Balb/c小鼠按2∶1比例合籠，建立正常妊娠孕鼠模型(CBA/J×Balb/c)；雌性CBA/J小鼠和雄性DBA/2小鼠按2∶1比例合籠，建立自然流產(chǎn)孕鼠模型(CBA/J×DBA/2)，合籠后每日8:00和14:00檢查陰道栓，以出現(xiàn)陰道栓為孕1 d。

孕鼠分組：①正常妊娠模型組(CBA/J×Balb/c)，Balb/c雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 mL FTY720，1次/d，連續(xù)2 d；②自然流產(chǎn)模型組(CBA/J×DBA/2)，不干預(yù)；③FTY720組(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 mL FTY720，1次/d，連續(xù)2 d；④FTY720+S1P-siRNA-DC組(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 ml FTY720，同時(shí)尾靜脈注射1 ml S1P-siRNA-DC(含2.5×106個(gè)細(xì)胞)，1次/d，連續(xù)2 d；⑤FTY720+過(guò)表達(dá)S1P-DC組(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 ml FTY720，同時(shí)尾靜脈注射1 ml過(guò)表達(dá)S1P-DC(含2.5×106個(gè)細(xì)胞)，1次/d，連續(xù)2 d；⑥FTY720+空載組(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 ml FTY720，同時(shí)尾靜脈注射1 ml空載慢病毒載體-DC(含2.5×106個(gè)細(xì)胞)，1次/d，連續(xù)2 d。

1.3.3計(jì)算孕鼠胚胎丟失率[9]

于孕12-14 d，對(duì)孕鼠胚胎丟失率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。丟失胚胎可見(jiàn)體積縮小、胎盤(pán)出血甚至壞死。胚胎體積縮小以胚胎體積<同齡胎盤(pán)平均體積減去2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，胚胎丟失率=丟失胚胎數(shù)/丟失胚胎數(shù)與存活胚胎數(shù)之和×100%。

1.3.4檢測(cè)DC數(shù)量及其表面CCR7/CCL19表達(dá)

于孕12-14 d采集孕鼠血樣(眼內(nèi)眥靜脈采血)，頸椎脫臼法處死孕鼠，留取蛻膜，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血和蛻膜組織中DC數(shù)量及其表面CCR7表達(dá)情況，具體方法參照前期研究[10,11]；取胎盤(pán)蛻膜組織，制備石蠟切片，按照CCL19抗體免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，檢測(cè)趨化因子CCL19表達(dá)情況，染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：±，+，++，+++，等級(jí)越高代表陽(yáng)性表達(dá)越多。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC凋亡及分化情況

獲取各組孕鼠骨髓來(lái)源DC[10,11]，重懸調(diào)整至1×106個(gè)/mL，分別加入100 μg/L、50 μg/L的重組GM-CSF和IL-4，于培養(yǎng)3 d、5 d時(shí)半量換液，加入細(xì)胞因子，于第5天收集部分細(xì)胞，離心后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD80、CD86、MHC-Ⅱ、CD40表達(dá)，剩余細(xì)胞加入100 μg/L的LPS，48 h后檢測(cè)細(xì)胞CD80、CD86、MHC-Ⅱ、CD40表達(dá)。

1.3.6Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DC趨化能力

趨化實(shí)驗(yàn)：將分離的DC液進(jìn)行重懸，用不含BSA的DMEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理過(guò)夜，重懸細(xì)胞調(diào)整濃度為1×105～1×106個(gè)/mL。將600 μl梯度濃度CCL19溶液加入24孔板，24孔板中放入Transwell小室，小室上室加入200 μl DC懸液(過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC和過(guò)表達(dá)S1P-DC前后與不同濃度的FTY720共培養(yǎng))，5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)20 h，取出小室，多聚甲醛固定(4%)20 min，結(jié)晶紫(0.1%)染色30 min，顯微鏡下觀(guān)察并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，以平均值表示。

中和實(shí)驗(yàn)：在上述含CCL19的溶液中，加入1 μg/mL CCL19抗體，于37 ℃條件下孵育1 h，其余步驟同趨化實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對(duì)孕鼠胚胎丟失率的影響

FTY720干預(yù)后自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率明顯降低(P<0.05)；過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，F(xiàn)TY720對(duì)自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率無(wú)明顯影響(P>0.05)；過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-DC后，F(xiàn)TY720能明顯降低自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組孕鼠胚胎丟失率

2.2 過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對(duì)孕鼠外周血DC數(shù)量及CCR7表達(dá)的影響

FTY720干預(yù)后自然流產(chǎn)孕鼠外周血DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率較干預(yù)前明顯降低(P<0.05)；過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，孕鼠外周血DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率無(wú)明顯變化(P>0.05)，過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC后，孕鼠外周血DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率進(jìn)一步降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 孕鼠外周血DC數(shù)量及表面CCR7的表達(dá)

2.3 過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對(duì)孕鼠蛻膜組織中DC數(shù)量及其CCR7表達(dá)的影響

FTY720干預(yù)后自然流產(chǎn)孕鼠蛻膜組織中DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率較干預(yù)前明顯降低(P<0.05)；過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，孕鼠蛻膜組織中DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率無(wú)明顯變化(P>0.05)，而過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-DC后，孕鼠蛻膜組織中DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率進(jìn)一步降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 孕鼠蛻膜組織DC數(shù)量及CCR7的表達(dá)

2.4 過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對(duì)孕鼠蛻膜組織中CCL19表達(dá)的影響

FTY720干預(yù)后自然流產(chǎn)孕鼠蛻膜組織中CCL19表達(dá)較干預(yù)前明顯降低(P<0.05)；在FTY720干預(yù)基礎(chǔ)上過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，孕鼠蛻膜組織中CCL19表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，而過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC后，孕鼠蛻膜組織中CCL19表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 孕鼠蛻膜組織中CCL19的表達(dá)

2.5 過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對(duì)DC分化及凋亡的影響

未干預(yù)前DC凋亡率為(8.21±0.25)%，過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC后，DC凋亡率為(8.33±0.33)%、(8.29±0.31)%，提示過(guò)繼轉(zhuǎn)移兩種慢病毒前后DC凋亡率無(wú)明顯差異(P>0.05)。各組孕鼠DC表面CD80、CD86、MHCII、CD40表達(dá)百分率無(wú)明顯差異(P>0.05)。

2.6 趨化實(shí)驗(yàn)和中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Transwell小室DC數(shù)量隨著FTY720濃度增加而減少(P<0.05)。過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，DC細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)；過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC后，DC數(shù)量明顯減少(P<0.05)。而加入CCL19抗體后，過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC或過(guò)表達(dá)S1P-DC前后DC數(shù)量無(wú)明顯變化(P>0.05)。

3 討論

母胎免疫耐受失衡是URSA的主要發(fā)病機(jī)理，探討誘導(dǎo)免疫耐受的方法可為URSA患者提供新的治療途徑。DC是母胎界面重要免疫活性細(xì)胞，其質(zhì)和量的異常在URSA中發(fā)揮重要作用，URSA患者局部組織中免疫活性細(xì)胞自外周被募集而來(lái)，而非由前體細(xì)胞在蛻膜中我更新形成，其中趨化因子及其受體在招募過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。

S1P與受體結(jié)合，可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞再分布，F(xiàn)TY720作為S1P受體激動(dòng)劑，可拮抗S1P與受體結(jié)合，與淋巴細(xì)胞遷移、凋亡以及歸巢密切相關(guān)[13]。本研究以FTY720干預(yù)孕鼠，同時(shí)構(gòu)建S1P過(guò)表達(dá)和S1P-siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染DC，觀(guān)察過(guò)繼轉(zhuǎn)移前后，F(xiàn)TY720對(duì)自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率的影響，結(jié)果顯示，F(xiàn)TY720能明顯降低自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率，過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，F(xiàn)TY720對(duì)自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率無(wú)明顯影響，過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-DC后，F(xiàn)TY720能明顯降低自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率，與前期研究結(jié)果一致[14]，提示FTY720可能通過(guò)阻斷S1P信號(hào)通路誘導(dǎo)免疫耐受。

為進(jìn)一步研究FTY720如何通過(guò)S1P信號(hào)通路影響相關(guān)免疫細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，本研究通過(guò)檢測(cè)孕鼠外周血和蛻膜局部組織中DC數(shù)量、DC表面CCR7和CCL19表達(dá)及DC凋亡分化情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)TY720能明顯減少DC數(shù)量，減少DC表面CCR7和CCL19表達(dá)，過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，DC數(shù)量明顯增多，而過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC后，DC數(shù)量明顯減少，同時(shí)CCR7和CCL19表達(dá)降低，而兩者對(duì)DC細(xì)胞凋亡和分化無(wú)影響，提示FTY720可能通過(guò)抑制DC表面趨化因子及其受體表達(dá)，致使趨化至母胎界面的DC數(shù)量減少，從而誘導(dǎo)免疫耐受，經(jīng)進(jìn)一步趨化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，F(xiàn)TY720與DC共培養(yǎng)后DC數(shù)量減少，過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，DC數(shù)量明顯增加，過(guò)繼轉(zhuǎn)移過(guò)表達(dá)S1P-DC后，DC數(shù)量明顯減少，而加入CCL19抗體后，過(guò)繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC和過(guò)表達(dá)S1P-DC前后DC數(shù)量無(wú)明顯變化，提示FTY720誘導(dǎo)免疫耐受，發(fā)揮降低自然流產(chǎn)孕鼠胚胎丟失率作用，可能是通過(guò)阻斷S1P信號(hào)通路干擾孕鼠體內(nèi)DC表面趨化因子及其受體表達(dá)，減少母胎界面DC細(xì)胞數(shù)量發(fā)揮免疫抑制作用。