張艷彥，晁 珂，金文龍

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科,吉林 延吉133000)

有研究表明，高膽固醇血癥、冠心病、2型糖尿病患者血清LR11水平增加，與糖代謝紊亂的生化指標(biāo)(空腹血糖、HbA1c)及動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素(年齡、LDL-C、頸動(dòng)脈IMT)相關(guān)[1-5]，在動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的動(dòng)脈斑塊內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)增高[6]。一些流行病學(xué)、血清學(xué)、組織病理學(xué)及臨床研究等提示幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter Pylori,HP)感染與動(dòng)脈硬化相關(guān)[7]，亦有研究認(rèn)為兩者不相關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)探討幽門(mén)螺桿菌外膜泡對(duì)2型糖尿病患者大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的LR11及動(dòng)脈硬化危險(xiǎn)因子表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 HP培養(yǎng)和HP-OMVs的提取

從哥倫比亞-腦心浸液固體培養(yǎng)基挑取單克隆幽門(mén)螺桿菌菌株(美國(guó)ATCC43504)活化制備種子液，并擴(kuò)大培養(yǎng)(5% O2、10% CO2和85% N2；37℃、120 rpm)，培養(yǎng)4天待菌液OD600≈1時(shí)，收集菌液，10 000 rpm離心收集上清，用0.45 μm濾頭過(guò)濾去除雜質(zhì)，用胞外囊泡分離試劑盒(exoEasy Maxi Kit，Qiagen，76064)收集胞外囊泡，-20℃保存?zhèn)溆谩?0 μl胞外囊泡液滴加到200目銅網(wǎng)表面，3-5 min后吸干殘余液體，再滴加20 μl 4%戊二醛溶液在室溫固定3-5 min，再用濾紙吸干殘余液體，用生理鹽水洗滌1次，室溫晾干，再滴加20 μl 2%磷鎢酸鈉，室溫染色3-5 min，吸干殘余液體，用生理鹽水洗滌1次，最后在電鏡下觀察HP-OMVs呈圓泡形，大小各異，直徑在50-200 nm之間(圖1)。囊泡濃度：采用BCA法(碧云天，試劑盒由中國(guó)上海Beyotime Biotechnology提供)檢測(cè)囊泡蛋白濃度。

圖1 HP-OMVs電鏡觀察

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

D-HAEC原代細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)Lonza公司，進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)中使用第4代細(xì)胞、美國(guó)Thermo Fisher Scientific細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)及Lonza EGM-2血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(CC-3162)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

培養(yǎng)D-HAEC 24 h，更換90 μl EGM-2培養(yǎng)基，加入10 μl不同濃度(2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml、10 μg/ml)HP-OMVs，對(duì)照組加入等體積PBS。取出96孔板，每孔加入CCK-8試劑10 μl，37℃孵育2 h，使用CCK-8試劑盒(日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所，Dojindo)，在450 nm處檢測(cè)吸光度(美國(guó)BioTek儀器有限公司Gen5酶標(biāo)儀)并計(jì)算細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4 分組

實(shí)驗(yàn)分為4組，C組(對(duì)照組，即Control組，無(wú)HP-OMVs和SQ22536)，HP組(有HP-OMVs，無(wú)SQ22536)，CS組(無(wú)HP-OMVs，有SQ22536)，HPS組(有HP-OMVs和SQ22536)。6孔板鋪設(shè)D-HAEC(Passage 4)，HP組和HPS組加入HP-OMVs共同培養(yǎng)24 h后，CS組和HPS組加入腺苷酸環(huán)化酶抑制劑(SQ22536)作用30 min，之后提取細(xì)胞總RNA。每組n=6。

1.5 Real-time PCR

從QIAGEN公司購(gòu)買(mǎi)Rneasy Plus Mini Kit、QuantiNova Rev Transcription Kit、QuantiNova SYBR Green PCR Kit，培養(yǎng)D-HAEC，提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達(dá)水平。引物產(chǎn)品號(hào):LR11(PPH06225A)，IL-1β(PPH00171C)，IL-6(PPH00560C)，MCP-1(PPH00192F)，TNF-α(PPH00341E)，VCAM-1(PPH00623E)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行ANOVA分析、Pearson相關(guān)分析及多元逐步回歸分析，P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HP-OMVs促進(jìn)D-HAEC的增殖

HP-OMVs(濃度2.5、5.0、7.5、10 μg/ml)與D-HAEC共同培養(yǎng)24 h，用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，隨HP-OMVs濃度的增加而D-HAEC數(shù)逐漸增多，HP-OMVs濃度7.5 μg/ml、10 μg/ml時(shí)，增殖率達(dá)125%、128%，與對(duì)照組比較有顯著性差異(圖2)。本實(shí)驗(yàn)采用7.5 μg/ml濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

2.2 LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達(dá)

HP組與C組比較，HP-OMVs可顯著增高D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達(dá)水平，當(dāng)加入腺苷酸環(huán)化酶阻滯劑(SQ22536)時(shí)，HPS組D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達(dá)水平被顯著抑制(表1)。Pearson相關(guān)性分析(表2)示LR11與IL-1β、IL-6、VCAM-1呈顯著正相關(guān)，與TNF-α有相關(guān)趨勢(shì)，多元逐步回歸分析示LR11與IL-1β最密切相關(guān)(表3)。

表1 各組間LR11及其他動(dòng)脈硬化危險(xiǎn)因素表達(dá)水平的比較

表2 LR11與其他動(dòng)脈硬化危險(xiǎn)因素的相關(guān)性

表3 LR11與其他動(dòng)脈硬化危險(xiǎn)因素的多元逐步回歸分析

3 討論

幽門(mén)螺桿菌外膜泡分泌的細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(CagA)和空泡毒素A(VacA)毒力非常強(qiáng)，可引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[9]。有研究報(bào)道，HP感染與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，引起胰島素抵抗[10]，增加炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表達(dá)[11]，促進(jìn)大血管動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展[12]。本實(shí)驗(yàn)研究中，HP-OMVs刺激的D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1表達(dá)水平顯著增加，多因素分析示LR11與IL-1β、IL-6、VCAM-1呈顯著正相關(guān)(r=0.967、0.733、0.683)，多元逐步回歸分析示LR11與IL-1β關(guān)系最密切(B=0.046，t=7.064，P<0.01)。并且，腺苷酸環(huán)化酶阻滯劑(SQ22536)可顯著下調(diào)HP-OMVs刺激的D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1表達(dá)水平，以上研究結(jié)果示幽門(mén)螺桿菌感染可能通過(guò)調(diào)控cAMP信號(hào)通路增高LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達(dá)水平，促進(jìn)糖尿病大血管動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展，其中，IL-1β可能是影響LR11的主要因素。另外，有研究報(bào)道LR11可調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增值、遷移，在本研究中觀察到HP-OMVs與2型糖尿病患者大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，這是否與LR11調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增值、遷移的作用有關(guān)尚不清楚。我們的前期臨床研究結(jié)果提示血清LR11水平與2型糖尿病及頸動(dòng)脈IMT相關(guān)[13-15]。幽門(mén)螺桿菌與冠心病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性薈萃分析示[16]，幽門(mén)螺桿菌可增加冠心病早期發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是在普通人群中，而其后期影響可能被其他動(dòng)脈硬化相關(guān)危險(xiǎn)因素所削弱，其中最主要的影響因素是年齡。多項(xiàng)HP與動(dòng)脈硬化相關(guān)性研究存在著爭(zhēng)議的原因可能為各項(xiàng)研究未能分層分析年齡因素。我們的研究結(jié)果顯示HP與動(dòng)脈硬化相關(guān)，因此HP的防治有可能會(huì)降低2型糖尿病患者大血管動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。