王月靜，張萌，劉丹陽，李林，張宇華，李盡賀，姚宏波（通訊作者）

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 組胚教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161000，2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院 普外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

0 引言

近年來，由于中國經(jīng)濟(jì)水平不斷提升，人們對(duì)高蛋白，高脂高糖的食物攝取量逐漸增多，從而導(dǎo)致人們飲食習(xí)慣逐漸變化。由于機(jī)器逐漸替代人工勞動(dòng)，人們的勞動(dòng)強(qiáng)度減低，諸多因素導(dǎo)致糖尿病發(fā)病率逐年增多。其臨床表現(xiàn)為血糖增高，這些患者多數(shù)出現(xiàn)神經(jīng)痛癥狀，他們常表現(xiàn)四肢疼痛及痛覺過敏，這些癥狀在勞累或壓力增加時(shí)疼痛會(huì)加重，嚴(yán)重影響他們的生命質(zhì)量，因此，探尋針對(duì) DNP 的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行有效防治的研究極為重要。目前有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1及ERK2參與疼痛反應(yīng)及脊髓損傷過程[1-2]，因此我們推測ERK2與糖尿病神經(jīng)病理性疼痛可能有關(guān)，本研究擬構(gòu)建腺病毒攜帶的反義細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（siERK2），我們研究團(tuán)隊(duì)將siERK2鞘內(nèi)注入DNP模型鼠體內(nèi)，觀察其對(duì)糖尿病神經(jīng)性疼痛模型鼠脊髓后角神經(jīng)元的形態(tài)及凋亡率影響，為糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑。鏈脲菌素（streptozotocin，STZ；S0130）購自Abcam；凋亡試劑盒購自武漢博士德，M_erk2-shRNA腺病毒購自上海吉?jiǎng)P公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模。健康8 w齡雄性C57/BL6小鼠30只自由飲食，鼠籠干凈衛(wèi)生，墊料一日一換，動(dòng)物在適應(yīng)環(huán)境 1周后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)均在標(biāo)準(zhǔn)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。隨機(jī)分三組：對(duì)照組，siERK2+DNP組（鞘內(nèi)注射M_erk2-shRNA腺病毒），DNP組，各組小鼠體重18-25 g，購置齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物合格證號(hào)（SCXK-2015-0001）。

1.3 DNP小鼠的模型制備。用專用飼料（高糖高脂）連續(xù)喂養(yǎng)1個(gè)月后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，注射兩次鏈脲霉素（STZ），注射劑量為30 mg/kg，第一次注射完成后，再過3天注射第二次，造模成功后測血糖（空腹），如果血糖值達(dá)到11.1 mol/L則造模成功，最后選出有疼痛并發(fā)癥小鼠。

1.4 鞘內(nèi)注射。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠固定后，選取進(jìn)針點(diǎn)為L5-L6椎骨間隙，用10 μL微量注射器注入藥物，當(dāng)注射到蛛網(wǎng)膜下腔時(shí)，可出現(xiàn)甩尾動(dòng)作及落空感。每只鼠注射2 μL，注射完畢后停留數(shù)秒，然后將針拔出，對(duì)照組與糖尿病組給予2 μL生理鹽水，各組連續(xù)給藥三天。

1.5 取材與固定。將各組小鼠用麻醉后取材，先將0.9%生理鹽水從左心室注入體內(nèi)，然后將小鼠全身注入固定液（4%多聚甲醛）后取材，切開背部皮膚后暴露脊髓，取出并置于固定液內(nèi)固定保存。

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察法。首先將脊髓組織制成切片，干燥后脫蠟，將切片浸入二甲苯Ⅰ10 min后，再浸入二甲苯Ⅱ10 min，再浸入100%的乙醇溶液2次，每次浸入10 min，然后分別放入90%、80%、70%、50%乙醇溶液中，每個(gè)溶液浸入5 min，最后放入蒸餾水沖洗5 min。將切片進(jìn)行HE染色，然后滴中性樹膠封固，晾干后觀察。

1.7 脊髓組織凋亡率檢測。我們應(yīng)用Tunel染色法進(jìn)行檢測，所有步驟按照說明書所說進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，組織染色陽性會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核棕黃色，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄各組脊髓后角陽性細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)脊髓后角神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理（應(yīng)用SPSS 13.0軟件），數(shù)據(jù)統(tǒng)一用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，應(yīng)用的分析方法為單因素方差分析（ANOVA），當(dāng)P＜0.05時(shí)，組間及組內(nèi)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色法。與對(duì)照組比較，DNP組脊髓后角細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞出現(xiàn)核固縮及壞死，與DNP組比較，siERK2+DNP組小鼠脊髓后角細(xì)胞數(shù)量較多排列相對(duì)規(guī)則，結(jié)果顯示下調(diào)ERK2表達(dá)對(duì)脊髓后角神經(jīng)元有保護(hù)作用。

2.2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。各組凋亡率結(jié)果分別為：對(duì)照組（1.92±0.51），siERK2+DNP組（2.17±1.39），DNP組（3.76±1.04），與對(duì)照組比較，DNP組小鼠脊髓后角神經(jīng)元凋亡率減顯著增多（P＜0.05），與DNP組比較，siERK2+DNP組小鼠的脊髓后角細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少（P＜0.05），推測下調(diào)ERK2表達(dá)可以降低脊髓后角神經(jīng)元的凋亡率。

3 討論

DNP是糖尿病常見并發(fā)癥之一[3]，一般急性發(fā)病的患者半年內(nèi)癥狀可逐漸減輕，隨著病情不斷發(fā)展，多數(shù)患者急性期的疼痛會(huì)發(fā)展為慢性神經(jīng)病理性疼痛。這些癥狀會(huì)伴隨患者多年，嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量，其發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)系統(tǒng)（包括中樞與外周神經(jīng)系統(tǒng)）敏化有關(guān)，而引起神經(jīng)系統(tǒng)敏化的原因有多種，如神經(jīng)纖維變性，炎癥反應(yīng)，脫髓鞘等，DNP成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，但其病因及發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，因此，找到有效的靶向藥物會(huì)給患者和家屬帶來福音。DNP發(fā)病機(jī)制至今不完全明了，其發(fā)病情況與高血糖有關(guān)，血糖升高可引起神經(jīng)營養(yǎng)障礙，此外，它會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)代謝紊亂，而在整個(gè)的DNP發(fā)病過程中，凋亡機(jī)制參與其中。凋亡的過程是機(jī)體自我保護(hù)的過程，通過一系列程序時(shí)損傷神經(jīng)元被消除，因此我研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用TUNNEL染色法觀察各組細(xì)胞凋亡率變化，進(jìn)一步討論ERK2對(duì)DNP小鼠模型的作用。

DNP的作用機(jī)制較復(fù)雜，其中抗炎因子，神經(jīng)與信號(hào)通路分子的變化與其發(fā)病密切相關(guān)，其中MAPKS信號(hào)通路在DNP發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用，ERK是MAPK家族中的一員，最近研究發(fā)現(xiàn)，該通路與疼痛相關(guān)的痛覺過敏有關(guān)，又有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1與ERK2在糖尿病模型鼠中表達(dá)都顯著增多，最近應(yīng)用腺病毒為載體，調(diào)節(jié)內(nèi)源性分子表達(dá)可對(duì)疼痛有治療作用[4-5]，因此，我們選擇ERK2作為治療靶點(diǎn)觀察鞘內(nèi)注射M_erk2-shRNA腺病毒后對(duì)DNP模型鼠影響，觀察下調(diào)ERK2表達(dá)后，DNP組脊髓后角神經(jīng)元形態(tài)及凋亡率改變，我們發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠脊髓后角細(xì)胞凋亡率下降，與我們預(yù)測相符，鞘內(nèi)注射M_erk2-shRNA腺病毒對(duì)DNP小鼠脊髓后角神經(jīng)元有保護(hù)作用。