宋 雪 陸 晨

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是常見(jiàn)的腎小球疾病類(lèi)型之一，發(fā)病率逐年上升，成為我國(guó)繼IgA腎病之后的第二大原發(fā)性腎小球疾病，且相對(duì)于繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy,SMN)，特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)較為常見(jiàn)[1-3]。IMN作為成人腎病最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，其臨床表現(xiàn)多樣，部分患者預(yù)后較差，治療仍較為棘手，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確。近年來(lái)，隨著對(duì)IMN發(fā)病機(jī)制研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)IMN的發(fā)生發(fā)展與某些基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)密切相關(guān)。已有研究[4]表明，磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor,PLA2R)與IMN進(jìn)展有關(guān)，且其存在基因突變和基因多態(tài)性，可能是引起IMN的主要靶抗原。但是，PLA2R基因多態(tài)性與IMN治療效果及預(yù)后的相關(guān)性研究較少。目前研究[5]認(rèn)為，SNP rs35771982位點(diǎn)位于PLA2R基因胞外結(jié)構(gòu)域中，可能影響PLA2R結(jié)構(gòu)和功能。因此，本研究通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)本院IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)基因型，分析其與成人IMN患者治療效果及預(yù)后的關(guān)系，以期為IMN臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年12月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢確診并治療的60例IMN患者為研究對(duì)象，病理診斷均符合Ehrenreich-Churg膜性腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。其中男性35例，女性25例，均為新疆維吾爾族人；年齡18～60歲，平均(48.65±15.36)歲。同期選取60例健康體檢者為對(duì)照組，其中男性31例，女性29例，均為新疆維吾爾族人；年齡18～60歲，平均(45.24±13.19)歲。兩組患者基礎(chǔ)資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.539，P=0.463；t=1.305，P=0.195)。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，所有樣品采集均取得患者或家屬知情同意并簽字。

1.2 試劑與儀器 PCR擴(kuò)增試劑盒(貨號(hào)DR011)購(gòu)自日本Takara公司；全血基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)D1800)購(gòu)自美國(guó)Santa公司；PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(貨號(hào)D6492-02)購(gòu)自美國(guó)Omega公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；核酸分析儀(型號(hào)2100)購(gòu)自Agilent公司；PCR擴(kuò)增儀(型號(hào)C1000)、凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)Gel Doc 1000)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 所有研究對(duì)象抽取清晨空腹靜脈血5 mL于含5% 乙二酸四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的抗凝管中。采用人全血基因組DNA提取試劑盒提取患者全血樣本中的基因組DNA，具體操作嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。經(jīng)核酸分析儀測(cè)定DNA產(chǎn)物的純度和濃度，確定其OD260/280為1.8～2.0后，將DNA稀釋后分裝，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)PLA2R基因rs35771982位點(diǎn)的基因型 參照文獻(xiàn)[7]及NCBI GenBank SNP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及比對(duì)，選擇位于人類(lèi)PLA2R基因Gene ID：22925(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)第5號(hào)外顯子區(qū)的rs35771982位點(diǎn)，并應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(引物序列見(jiàn)表1)。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Premix Taq 10 μL，ddH2O 6 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Bbs I酶切，37℃消化4 h，65℃ 30 min終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶分布情況，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用Chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果，確定每例IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)基因型。

表1 PCR引物序列

1.3.3 隨訪及觀察指標(biāo) IMN組患者隨訪時(shí)間為12個(gè)月，隨訪過(guò)程中觀察每例患者的血壓、24 h尿蛋白定量、血清清蛋白、血肌酐、血清總膽固醇、血清三酯甘油等指標(biāo)，并根據(jù)慢性腎臟病流行病學(xué)合作研究(CKD-EPI)公式計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)。同時(shí)，記錄患者在治療期間發(fā)生的血糖、尿酸異常升高等不良反應(yīng)，以空腹血糖值≥6.0 mmol/L為血糖異常，以尿酸值≥420 μmo1/L為尿酸異常，比較不同基因型間血糖、尿酸異常率。

1.4 臨床療效評(píng)價(jià) 參照《中國(guó)成人腎病綜合征免疫抑制治療專(zhuān)家共識(shí)(2014)》進(jìn)行療效判定[8]：①24 h蛋白尿定量<0.3 g，血清清蛋白>35 g/L，尿蛋白陰性為完全緩解；②0.3 g<24 h蛋白尿定量<3.5 g或24 h尿蛋白定量比基線水平下降50%且腎功能穩(wěn)定為部分緩解；③24 h尿蛋白定量>3.5 g，且下降幅度小于基線水平的50%為未緩解；④經(jīng)治療后緩解的患者重新出現(xiàn)24 h尿蛋白定量>3.5 g為復(fù)發(fā)。比較不同基因型間完全、部分緩解率以及復(fù)發(fā)率，并以完全緩解與部分緩解定義為預(yù)后良好，未緩解以及復(fù)發(fā)定義為預(yù)后不良。

2 結(jié)果

2.1 IMN組與對(duì)照組PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)的基因型比較 測(cè)序結(jié)果顯示，PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)存在G/C突變，有野生型純合子GG、突變型雜合子GC、突變型純合子CC 3種基因型。IMN組60例患者中GG 6例(10.00%)、GC 16例(26.67%)、CC 38例(63.33%)，G等位基因頻率為23.33%，C等位基因頻率為76.67%，且其GG基因型、G等位基因比例顯著低于對(duì)照組，CC基因型、C等位基因比例顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 IMN組與對(duì)照組PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)基因型及等位基因分布比較[例(%)]

表3 IMN患者PLA2R基因 SNP rs35771982位點(diǎn)基因多態(tài)性與治療緩解率的關(guān)系[例(%)]

表4 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)基因多態(tài)性與復(fù)發(fā)率的關(guān)系[例(%)]

表5 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)基因多態(tài)性與不良反應(yīng)的關(guān)系[例(%)]

2.5 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)基因多態(tài)性與不良預(yù)后的logistic回歸分析 以本研究資料中CC、GC、GG基因型(GG型=0；GC型=1；CC型=2)、年齡(<45歲=0；≥45歲=1)、血肌酐(<186 μmol/L=0；≥186 μmol/L=1)、24 h尿蛋白定量(<3.5 g=0；≥3.5 g=1)為自變量，以預(yù)后情況(預(yù)后良好=0；預(yù)后不良=1)為因變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。在調(diào)整年齡、血肌酐、24 h尿蛋白定量等后，結(jié)果顯示，SNP rs35771982位點(diǎn)CC基因型是影響IMN患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR值=6.634，P<0.001)，相較于GG基因型，CC基因型患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)為6.634倍。見(jiàn)表6。

表6 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)基因多態(tài)性與不良預(yù)后的logistic回歸分析

3 討論

PLA2R基因位于人類(lèi)染色體2q23-q24區(qū)，其內(nèi)部包含許多SNP位點(diǎn)。研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，PLA2R基因SNP位點(diǎn)及基因多態(tài)性可通過(guò)影響PLA2R抗體形成及足細(xì)胞表面PLA2R表達(dá)影響IMN的進(jìn)展。目前，研究[13]證實(shí)，PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)突變是IMN發(fā)病的危險(xiǎn)因素，該位點(diǎn)發(fā)生G/C突變后天冬氨酸取代組氨酸，導(dǎo)致C型鈣離子依賴(lài)性凝集素結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)變化，PLA2R的抗原表位暴露并產(chǎn)生特異性抗PLA2R抗體，促進(jìn)IMN發(fā)生發(fā)展，并可能影響預(yù)后。郭玉等[7]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)新疆維吾爾族IMN患者rs35771982位點(diǎn)中CC基因型、C等位基因是其易感基因，也是功能基因。本研究發(fā)現(xiàn)，IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)存在GG、GC、CC三種基因型，以CC基因型居多，約占63.33%，且其CC基因型、C等位基因占比顯著高于健康對(duì)照組，推測(cè)中國(guó)新疆地區(qū)維吾爾族IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)CC基因型、C等位基因可能與IMN的進(jìn)展密切相關(guān)，與郭玉等[7]研究結(jié)果相一致。

Hoxha等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IMN患者PLA2R抗體水平與蛋白尿達(dá)到緩解的時(shí)間具有一定相關(guān)性，其是影響IMN緩解的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可用于監(jiān)測(cè)IMN的治療效果及預(yù)后。彭佳楠等[14]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)寧夏地區(qū)攜帶PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)GG基因型的IMN患者較攜帶CG/CC基因型的患者完全/部分緩解率降低，且rs35771982位點(diǎn)GG基因型是IMN的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其與疾病的預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)CC基因型患者的完全/部分緩解率、復(fù)發(fā)率顯著低于GC、GG基因型患者，而GC、GG基因型患者的完全/部分緩解率、復(fù)發(fā)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IMN患者攜帶PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)CC基因型可能不利于IMN疾病的治療，且預(yù)后較差，推測(cè)這可能與CC基因型影響PLA2R抗體水平相關(guān)。

目前，臨床上多使用免疫抑制劑治療IMN，雖然具有一定的臨床療效，但是環(huán)磷酰胺、他克莫司等免疫抑制劑帶來(lái)的不良反應(yīng)幾乎難以避免。本研究發(fā)現(xiàn)，PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)CC基因型患者的血糖異常率GG基因型，尿酸異常率顯著高于GC、GG基因型，提示IMN患者攜帶CC基因型可能促進(jìn)血糖、尿酸等不良反應(yīng)的發(fā)生，降低治療療效和安全性，且預(yù)后較差。進(jìn)一步通過(guò)logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，CC基因型是影響IMN患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)CC基因型的存在提高了IMN治療的難度，并嚴(yán)重影響預(yù)后。

綜上所述，中國(guó)新疆地區(qū)維吾爾族IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能與IMN治療效果及預(yù)后密切相關(guān)，并且rs35771982位點(diǎn)CC基因型是影響IMN患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究局限于樣本含量相對(duì)較少，隨訪時(shí)間較短，PLA2R基因多態(tài)性對(duì)IMN患者治療效果及預(yù)后的影響及其機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。