張林，周劍光，張濤，何力

(中國水產科學研究院長江水產研究所， 農業(yè)農村部淡水魚類種質監(jiān)督檢驗測試中心， 湖北 武漢 4300223)

中華鱉(Pelodiscussinensis)屬爬行綱(Reptilia)、龜鱉目(Chelonia)、鱉科(Trionychidae)、鱉屬(Pelodiscus)，俗稱甲魚、水魚或團魚[1]。分布區(qū)域較廣，在俄羅斯(東部)、越南(北部)、中國、韓國及日本等國均有分布[1-2]。在中國除新疆、西藏和青海外，都有分布，主要生長在華南地區(qū)和長江流域[1,3]。中華鱉主要有黃河品系、日本品系、淮河品系、臺灣品系、洞庭湖品系及鄱陽湖品系，在生產性狀、體表顏色和裙邊大小等方面都存在一定差異。黃河品系、日本品系及淮河品系因生長速度較其他品系快、抗病性強、品質好、繁殖力強且耐存放運輸?shù)忍匦远蔀橹饕B(yǎng)殖品系。中華鱉因肉味鮮美，含鈣、鐵、磷、核黃素、硫胺素、尼克酸、蛋白質和維生素等多種營養(yǎng)元素，尤以裙邊富含膠原蛋白，備受人們喜愛[4-5]。此外，中華鱉也具有很高的藥用價值[5-7]。因此，近年來，中華鱉作為重要的名優(yōu)經濟特種水產品種，養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，產量持續(xù)增長，每年產量高達32萬 t，暢銷國內外市場[5]。然而養(yǎng)殖場(戶)不規(guī)范引種、倒種，忽視培育品種等行為導致中華鱉種質情況混亂，造成了部分種群的混雜和優(yōu)良種質特性退化，如造成中華鰲生長速度減慢、抗病抗逆性能下降、生長規(guī)格不整齊和畸形率增加等[6]，嚴重破壞了中華鱉的種質資源。種質是產業(yè)的源頭，關系著養(yǎng)殖戶的切身利益，因此，對中華鱉種質資源進行評估與保護迫在眉睫。

目前對中華鱉的種質資源研究報道不多見，僅限于采用框架測量方法進行形態(tài)差異性分析[8]。本研究以淮河品系、黃河品系和日本品系中華鱉為研究對象，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法[9]，結合經典的細胞[10]及生化遺傳[11]特性進行差異性比較分析，旨在為其種群鑒定、種質標準制定、種質資源評估及今后中華鱉新品種(系)的選育提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本試驗選用健康的淮河品系、黃河品系和日本品系中華鱉，每個品系雌雄各30只，隨機抽樣，均為池塘養(yǎng)殖的2～3齡中華鱉，體質量無顯著差異。且均采集于安徽省喜佳農業(yè)發(fā)展有限公司，所有品系的中華鱉飼養(yǎng)條件一致。雌雄性別通過外部形態(tài)特征技術確定。

1.2 形態(tài)學數(shù)據測量

參照《中華鱉》(GB 21044—2007)[9]，測定了3個品系中華鱉的11項形態(tài)學指標，包括體質量、背甲長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬、體高、吻長(上頜前緣至眼睛之間垂直距離)、吻突長(鼻孔前端無骨部分長度)、眼間距(兩眼框上緣之間的距離)、吻突寬(吻端最大的寬度)和后側裙邊寬(尾基部上方裙邊寬度)?？闪繀?shù)用游標卡尺測量(精確度為0.01 mm)，體質量采用電子天平進行測量(精確度為0.01 g)。

1.3 數(shù)據分析

可測量形態(tài)學指標用SPSS 11.0軟件(美國，SPSS公司)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，然后采用Duncan法作群體間差異顯著性檢驗。

1.4 染色體的制備

3個不同品系的中華鱉雌雄各3只，按照5 μg/g的劑量由后腿肌肉和腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，飼養(yǎng)24 h后，按照2 μg/g的劑量由后腿肌肉注射秋水仙素，3 h后斷頭放血取腿骨及脊椎。將腿骨及脊椎剪成1 mm3，然后在直徑10 cm的研缽中加入3～5 mL生理鹽水研磨，靜置10 min，取上層細胞懸液1 000 g離心6 min，沉淀加入0.0375 mol/L的KC1溶液 5 mL，室溫低滲45 min。加少許卡諾氏固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1，V/V)預固定1～2 min 后，1 000 g離心6 min，沉淀加入預冷的卡諾氏固定液，吹打均勻后室溫靜置30 min固定，以1 000 g離心6 min，離心后去上清液。如此重復3次后，取沉淀加少量固定液混勻后用空氣干燥法制作涂片，涂片用15%Giemsa液染色。

1.5 染色體觀察與指標測量

在顯微鏡(Olympus IX83)下用16倍目鏡和100倍油鏡觀察拍攝，對采樣的每只鱉均進行隨機拍攝，每個品系至少拍攝100張清晰的中期分裂圖。進行數(shù)據統(tǒng)計，確定染色體眾數(shù)。染色體大小用Photoshop Software 7.0測量。每個品系挑選具有代表性的5張中期分裂圖，按照著絲點分割點位置對染色體進行排號(1～66)，測量每條染色體的長臂長、短臂長和總長。每對同源染色體，取5對短臂與長臂均值，計算相對長度、著絲粒指數(shù)和臂比等，用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，按照組型歸類。

1.6 染色體配對

染色體的配對參考文獻[10,12]的方法。著絲粒指數(shù)(CI)指每對染色體短臂均值長與此對染色體總長之比。相對長度指每對染色體總長和所有染色體總長之比。根據同源染色體總長及著絲粒位置的最大相似性進行配對。臂比指長臂長與短臂長之比。按臂比及著絲粒指數(shù)將染色體分為4組：中部著絲粒染色體M組，臂比為1.00～1.70，CI為0.375～0.500；亞中部著絲粒染色體SM組，臂比為1.71～3.00，CI為0.250～0.375；亞端部著絲粒染色體ST組，臂比為3.01～7.00，CI為0.125～0.250；端部著絲粒染色體T組，臂比為7.01～∞，CI為0.000～0.125[12]。在每組內根據同源染色體長度逐漸下降的順序排列。

1.7 單態(tài)同工酶制備及測定

1.7.1 同工酶樣本的制備

每個品系選取20只鱉，首先剪斷頸動脈放血，在低溫條件下(冰上操作)迅速解剖，取出腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉和眼晶狀體7種組織，在玻璃勻漿器中勻漿(冰水浴中)，組織和提取緩沖液質量體積比為1∶3，提取液為0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.1)，4 ℃下12 000 g離心20 min后取上清液，重復離心2次，上清液置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 同工酶的篩選與電泳

為從生化遺傳的角度區(qū)分鑒別3個品系中華鱉，首先在所測樣本中每個品系選取8只鱉，取心、肝、脾、腎、肌肉和眼進行乳酸脫氫酶(LDH)、酯酶(EST)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、醇脫氫酶(ADH)、山梨醇脫氫酶(SDH)、谷氨酸脫氫酶(GDH)及葡萄糖磷酸變位酶(PGM)聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定某種組織的某種同工酶是單態(tài)，再從所測樣本中隨機抽取10只健康鱉對該組織該同工酶進行驗證，以初步確定該品系特有的生化遺傳標記。

采用分離膠7.5%，濃縮膠3.5%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電極緩沖液為pH 8.3的Tris-甘氨酸，以220 V穩(wěn)壓電泳，4 ℃條件下，電泳5 h。至溴酚藍指示劑至凝膠底部時停止電泳。電泳結束后將凝膠板取下，在染色液中避光染色至條帶出現(xiàn)，顯色至出現(xiàn)清晰條帶后固定[11-13]。

2 結果與分析

2.1 3個品系中華鱉形態(tài)特征差異性比較

3個品系中華鱉外觀形態(tài)特征如圖1所示。日本品系中華鱉背部是暗綠色，淮河品系背部呈黃褐色，而黃河品系背部呈黃褐色或土黃色。日本品系背甲后部表皮上有突起的小疣突，而淮河品系和黃河品系背甲表皮上有突起的小疣突，尤以后部明顯且集中，3個品系背甲后部是否有明顯且集中的小疣突，是區(qū)分三者的重要標志之一。日本品系腹甲中心及后約1/4處未見淡綠色斑塊，而淮河品系及絕大多數(shù)黃河鱉腹甲中心及后約1/4處隱約可見2個淡綠色斑塊，腹甲是否有淡綠色斑塊可以初步從外觀上將日本品系與其他兩個品系區(qū)分開。此外，黃河品系的裙邊相對其他2個品系的裙邊較寬，而淮河品系以背甲最寬處為界，背甲后部寬度明顯比前部窄許多，此特征使淮河品系可區(qū)別于日本品系及黃河品系。3個品系中華鱉外部形態(tài)特征差異性描述見表1。雄性淮河鱉及雌性黃河鱉背甲寬/背甲長的比值與其他鱉差異顯著，雌性懷河鱉體高/背甲長與其他鱉差異顯著。雌性日本品系后側裙邊寬/背甲長差異明顯。3個品系鱉的吻長/背甲長、吻突長/背甲長、吻突寬/背甲長、眼間距/背甲長差異均不明顯。3個品系中華鱉形態(tài)學指標見表2。

圖1 3個品系中華鱉正面背面圖a～c分別為淮河品系、日本品系及黃河品系中華鱉背面;d～f分別為淮河品系、日本品系及黃河品系中華鱉腹面。Fig.1 The back and abdomen profile of three strains of Chinese turtlea-c:is the back of Huai River strain, Japanese strain and Yellow River strain respectively;d: The abdomen of Huai River strain of Chinese turtle d-f was the abdomen of huai River strain, Japanese strain and Yellow River strain.

表1 3個品系中華鱉外部形態(tài)特征差異性比較Tab.1 Comparison of external morphological characteristics of three strains of Chinese turtle

表2 3個品系中華鱉各性狀參數(shù)比值Tab.2 The ratio of characters and parameters of three strains n=30

2.2 細胞遺傳學性狀

淮河品系有100張有絲分裂中期相，染色體個數(shù)范圍為52～68，眾數(shù)為66的有85張，占有絲分裂中期相的85%；其余10張為減數(shù)分裂期，染色體個數(shù)在23～35，個數(shù)為33的有7張(占減數(shù)分裂相的70%)。日本品系拍攝的102張有絲分裂相，染色體個數(shù)范圍為54～68，眾數(shù)為66的占82%，16張減數(shù)分裂相中，染色體個數(shù)為33的有9張(占56%)；黃河品系101張染色體中期分裂相中，眾數(shù)為66的有88張(占87%)，12張減數(shù)分裂相中，個數(shù)為33的有8張(占67%)。由此推斷3個品系中華鱉均屬于二倍體，染色體個數(shù)為66，減數(shù)分裂期時屬于單倍體；此外，均未發(fā)現(xiàn)與性別有關的異形染色體。

每組中的同源染色體按總長逐漸減小的順序排列，3個品系中華鱉染色體中期分裂相及核型圖(圖2)，中華鱉黃河品系核型公式為2N=16M+10SM+8ST+12T+20MC，臂數(shù)NF=92。中華鱉日本品系核型公式為2N=16M+12SM+8ST+16T+14MC，臂數(shù)NF=94。中華鱉淮河品系核型公式為2N=4M+8SM+20T+34MC，臂數(shù)NF=78。

圖2 3個品系中華鱉染色體中期分裂相及核型圖a,c,e分別為黃河品系、日本品系及淮河品系中華鱉染色體中期分裂相(×1 000);b,d,f分別為黃河品系、日本品系及淮河品系中華鱉染色體組型(標尺=5 μm)M表示中部著絲點染色體；SM表示亞中部著絲點染色體；ST表示亞端部著絲點染色體；T表示端部著絲點染色體；MC表示微小染色體。Fig.2 The metaphase chromosome division phase and karyotype of three strains of Chinese turtlea, c and e were the metaphase chromosome division phase of the Yellow River strain, the Japanese strain and the Huai River strain (×1 000)；b, d and f were the Yellow River strain, the Japanese strain and the Huai River strain, respectively (scale=5 μm)M represents the centromere chromosome in the middle; SM represents the centromere chromosome in the sub-middle; ST represents the centromere chromosome at the sub-end; T is for centromere chromosomes at the ends; MC is for tiny chromosomes.

2.3 遺傳學性狀

通過組織特異性的同工酶酶譜篩查，發(fā)現(xiàn)3個品系肌肉LDH酶譜均為單態(tài)，其他組織其他酶均表現(xiàn)有多態(tài)現(xiàn)象，其組織特異性酶譜及遺傳結構分析將在另一文中報道。

肌肉中的LDH，觀察到6～9個基因座，均由Ldh-A、Ldh-B、Ldh-C3個基因編碼的四聚體酶，分別為A4、A3B、A2B2、AB3、B4、C4、AC3、A2C2和BC3編碼。日本品系顯示6條清晰的同工酶譜帶，黃河品系顯示8條清晰的同工酶譜帶，淮河品系顯示9條清晰的同工酶譜帶，除LDH1外，活性均較強。LDH電泳圖譜(圖3)，均為各自特異性的生化遺傳學標記。由于基因表達豐度及相應蛋白大小不同，因此，在遷移率和條帶的著色濃度上存在細微差別，顯示同種酶在同一物種上因品系不同而具有組織特異性，可以作為鑒別標記之一。

圖3 3個品系中華鱉肌肉組織乳酸脫氫酶a～c分別為中華鱉日本品系、黃河品系、淮河品系肌肉組織乳酸脫氫酶1～10分別為各品系中華鱉的1～10個個體。Fig.3 Lactate dehydrogenase (LDH) in muscle tissue of three strains of Chinese turtlea-c respectively shows lactate dehydrogenase (LDH) in muscle tissue of Japanese strain, Yellow River strain and Huai River strain of Chinese turtle1-10 are 1-10 individuals of each strain.

3 討論

傳統(tǒng)的形態(tài)學分析方法已經被廣泛應用在水產動物的形態(tài)特征分析方面，并在不同群體(水系)水生動物的形態(tài)特征分析方面得到良好的應用[14-15]。在中華鱉上，劉陽等[16]曾對中華鱉5個不同群體的形態(tài)學特征進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)不同流域中華鱉群體形態(tài)差異較大。本研究對3個品系中華鱉的7個性狀比值進行分析，能較好反映所測中華鱉的形態(tài)性狀信息，將可量性狀與背甲長相比，反映了中華鱉的體型特征，更好地反映了3個品系之間的形態(tài)差異。此外，通過對外形特征進行描述，找到區(qū)分點，能直觀的初步區(qū)分3個品系外部形態(tài)特征是種質鑒定的重要方法之一，此法簡單直觀，但容易受環(huán)境條件影響而改變，有一定的局限性[16]。本研究對黃河、日本及淮河3個品系中華鱉成鱉外形特征進行比較分析，結果發(fā)現(xiàn)淮河鱉以背甲最寬處為界，背甲后部寬度明顯比前部窄許多。體型參數(shù)比值體現(xiàn)為：體高/背甲長比值較其他2個品系大，且雌雄差異顯著，其機理可能與性別遺傳有關。黃河鱉裙邊相對較寬，可能受遺傳環(huán)境的影響。梁宏偉[8]通過框架測量方法，建立判別函數(shù)分析形態(tài)差異性。而本研究采用傳統(tǒng)的測量方法與梁宏偉[8]研究結果一致。兩種方法均表明淮河鱉與其他兩個品系的形態(tài)差異更為明顯，相比較而言，黃河鱉與日本鱉的形態(tài)特征差異較小。

染色體作為遺傳信息的載體具有種(系)的特異性，不同的物種有其特定的染色體組型。核型分析是細胞遺傳學研究的重要手段，是從細胞水平認識水生生物種質資源特征的方法，其主要內容是確定種質的染色體數(shù)目和組型[14,17]。本研究中，盡管3個品系中華鱉染色體數(shù)目在進化上比較保守，二倍體數(shù)都是66，但臂數(shù)變化較大(NF=78～94)，且核型各不相同，絕對長度與相對長度均有差異，且各自均有其特有的核型。黃河鱉與日本鱉的核型及臂數(shù)比較差異不顯著(P>0.05)，但黃河鱉ST組染色體較SM組大。淮河鱉核型及臂數(shù)，與其他兩種鱉相比較差異極顯著(P<0.01)，且無亞端部染色體，微小染色體相對較多，可能與遺傳本質有關。

淮河鱉染色體臂數(shù)NF=78，與黃河鱉及日本品系兩者間差異極顯著(P<0.01)?；春悠废等旧w核型公式：2N=66=4M+8SM+20T+34MC，臂數(shù)NF=78；國標中[9]核型公式：2N=66=4M+8SM+16T+38MC，臂數(shù)NF=78；兩者相比，核型有細微變化，臂數(shù)一致，可能因制備方法不同而導致，推測國標[9]所用樣本可能是中華鱉淮河品系。中華鱉黃河品系與日本品系核型比較保守，可歸納為2N=66=16M+(10-12)SM+8ST+(12-16)T+(14-20)MC，臂數(shù)NF=(92～94)，差異不顯著(P>0.05)，推測其親緣關系較近。

同工酶是分析種質生化遺傳標記的經典方法，可從宏觀的角度體現(xiàn)孟德爾遺傳變化規(guī)律[18]。本研究經多種組織多種同工酶酶譜特異性篩查，發(fā)現(xiàn)肌肉LDH可作為3個品系中華鱉特有的生化遺傳標記。LDH催化乳酸和丙酮酸相互轉化并伴隨發(fā)生輔酶NAD氧化還原反應，存在于生物所有組織細胞中，參與組織的有氧/無氧酵解[19-20]代謝活動，在肌肉中表達豐富?？赡芤驗樯锏募∪饣顒虞^頻繁，糖的代謝較旺盛。盡管LDH酶的表達與活性存在時間、空間差異性，但其編碼基因的表達都能在酶譜上體現(xiàn)，能精準反映物種受基因遺傳表達與環(huán)境因素調控[13,20]。

LDH為四聚體酶，至少有Ldh-A、Ldh-B、Ldh-C3個基因編碼，比較經典的是由Ldh-A、Ldh-B兩個基因編碼的5條酶帶[21-22]。本研究為從生化標記鑒別3個品系，首先從廣譜的酶系對多種組織多個酶譜進行篩選，找到3個品系各自特異性的酶譜——LDH。發(fā)現(xiàn)3個品系肌肉LDH均為單態(tài)，且有Ldh-A、Ldh-B、Ldh-C基因編碼的大于5條酶帶，說明中華鱉3個品系肌肉中LDH的遺傳多樣性處于中上等地位，可用于區(qū)分3個品系的特異性生化標記。

中華鱉屬兩棲爬行動物，肌肉中多進行無氧酵解，LDH4與LDH5活性較高，富含A亞基，催化丙酮酸轉變?yōu)槿樗峒癗AD+，而本研究中除LDH1活性較差外，其他酶帶活性均較強，這一結果很好地證明了此理論。盡管3個品系肌肉中LDH表達具有差異性，淮河品系肌肉中LDH酶帶更豐富，黃河品系次之，日本品系表達最少，可能是受不同基因位點調控的結果，而受生存環(huán)境的影響不大。本研究中還發(fā)現(xiàn)3個品系雌雄鱉肌肉LDH的條帶數(shù)及酶的活性強度之間無明顯差別，可能與其進化地位不高有關。這些研究結果表明，同工酶具有組織和品系(種群)特異性，與其生理條件和機能相關[19-20]，受遺傳基因表達調控。

通過中華鱉3個品系表型、核型及LDH分析，發(fā)現(xiàn)淮河品系差異與其他2個品系差異較大，說明黃河品系與日本品系親緣關系較近，而與淮河品系親緣關系較遠。為中華鱉品系間雜交育種和親緣關系研究提供了基礎。同時，中華鱉同工酶豐富度反映品質性狀，利用該項指標評價中華鱉種質資源，可以挖掘出抗逆性強的優(yōu)質種質資源。用同工酶指標評價中華鱉品系，篩選生長速度快、適應性強、肉質鮮嫩的品種，兼顧養(yǎng)殖戶利益，有利于中華鱉產業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

4 結論

通過對3個品系中華鱉的形態(tài)特征、生化及細胞遺傳學特性研究，發(fā)現(xiàn)中華鱉因品系不同，其生物學性狀不一致，存在著群體差異性。3個品系中華鱉體細胞染色體數(shù)雖都為2N=66，核型公式不一樣，臂數(shù)NF=(78～94)不一樣，且差異顯著(P<0.05)，但均未發(fā)現(xiàn)性染色體。肌肉組織中乳酸脫氫酶帶(LDH)表達量豐富，條數(shù)不同(日本品系6條、黃河品系8條、淮河品系9條)，且差異顯著(P<0.05)，酶帶條數(shù)均大于經典的乳酸脫氫酶5條酶帶數(shù)，由Ldh-A、Ldh-B、Ldh-C3個基因編碼，均表現(xiàn)較強活性。本研究可為3個品系中華鱉種質評估、鑒定提供理論參考。