張春玲，王賀玲，盧 艷*

（1.廊坊長征醫(yī)院心內(nèi)科，河北 廊坊 065000；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 心內(nèi)科，哈爾濱 150000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）是一種來源于胚胎發(fā)育時期的中胚層細(xì)胞，具有較強(qiáng)的自我復(fù)制和多項分化潛能的成體干細(xì)胞[1]。既往研究證實BMSCs 在特定的環(huán)境和培養(yǎng)條件下能夠分化成為多種功能性細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及成骨細(xì)胞等[2-3]。近年來，心血管疾病以及腫瘤發(fā)病率已經(jīng)成為危害人類健康重要殺手。有關(guān)抗血管性疾病（糖尿病血管病變、冠心病、高血壓以及肺病等）藥物和抗腫瘤藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。但是臨床藥物的使用并不能從根本上改善患者的機(jī)體狀態(tài)。因此，越來越多的研究者將目標(biāo)投向干細(xì)胞治療，BMSCs 因為具有易于分離和培養(yǎng)、生長迅速以及多項分化和低免疫等特點在治療心血管疾病以及腫瘤中發(fā)揮重要作用[4-5]。通過揭示BMSCs 的增殖和分化機(jī)制對疾病相關(guān)干細(xì)胞治療具有重要意義。

人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2，Rh2）作為人參的主要有效成分之一，具有廣泛的抗腫瘤活性以及治療心血管病變等作用[6-7]。王樂等[8]研究發(fā)現(xiàn)Rh2 能夠顯著增加催產(chǎn)素誘導(dǎo)BMSCs 向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，Rh2 能夠調(diào)控PI3K/Akt 信號通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。另外，PI3K/Akt 在對多種類型細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，包括參與了BMSCs 增殖[9]。因此，本研究擬通過分離培養(yǎng)大鼠BMSCs 探究Rh2 能否通過調(diào)控PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)BMSCs 增殖作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SPF 級SD 大鼠共2 只，周齡3～6周，體質(zhì)量為180～220 g，購買于凱學(xué)生物科技（上海）有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0006），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間飼養(yǎng)環(huán)境為12 明暗交替，自由飲水，飲食。細(xì)胞組織勻漿儀（H22539，武漢維塞爾生物科技有限公司）；-80 ℃超低溫冰箱（DW-86L578J，青島海爾集團(tuán)）；4 ℃、-20 ℃冰箱（FYLYS-128，合肥美菱股份有限公司）；高速臺式冷凍離心機(jī)（SKFH-1600RW，湖南湘儀實驗室儀器有限公司）；Western blot 檢測裝置（125-0098，美國Bio-Rad 伯樂公司）；高純水機(jī)（CSB-20L，美國Millipore 公司）；酶標(biāo)儀器（HBS-1096A，上海研卉生物科技有限公司）。人參皂苷Rh2（上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，純度＞98%）；LY294002（美國Cell Signaling Technology公司）；L-DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（C11960500BT，gibco公司）；成脂、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（濟(jì)南中賽生物）；胎牛血清（10099-141，gibco 公司）；PI3K 抗體（△13158，美國Cell Signaling Technology 公司）、Akt抗體（△24232，美國Cell Signaling Technology公司）、p-Akt 抗體（△12703，美國Cell Signaling Technology公司）、β-actin 抗體（△54943，美國Cell Signaling Technology 公司）；HRP 標(biāo)記兔二抗（A0227，武漢博士德公司）、HRP 標(biāo)記鼠二抗（A0286，武漢博士德公司）；一抗稀釋液（P0256，江蘇碧云天公司）、二抗稀釋液（P0023D，江蘇碧云天公司）；CCK-8 檢測試劑盒（AF0216，江蘇碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng) 利用頸椎脫臼法處死大鼠，并在無菌條件下分離大鼠四肢長骨盡量去除殘多余殘留組織。使用磷酸緩沖鹽溶液（含有1%青鏈霉素）混合溶液多次沖洗大鼠長骨兩端使其暴露髓腔，隨后通過注射器吸取適量的DMEM 培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集得到細(xì)胞。最后將收集得到的骨髓腔細(xì)胞放置于DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中重懸，接種于面積為25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)環(huán)境在設(shè)置溫度37 ℃、CO2含量5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每隔2～3 d 進(jìn)行細(xì)胞換液處理，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%結(jié)束原代細(xì)胞培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。[3]

1.2.2 細(xì)胞純化 原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)1～2周且融合度達(dá)80%～90%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時用0.25%胰蛋白酶（含 0.02%乙二胺四乙酸）消化2 min，胎牛血清終止消化。終止消化后按照離心機(jī)設(shè)定，轉(zhuǎn)速：1 000 r/min，離心5 min 收集細(xì)胞，最后將重懸后細(xì)胞接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。[8]

1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂分化[7]1）成骨分化：將上述培養(yǎng)的細(xì)胞以密度為2×105個細(xì)胞接種至6 孔板中（6 孔板預(yù)先通過0.1%的明膠處理30 min并清洗），待細(xì)胞生長融合度達(dá)到60%～70%時，向培養(yǎng)板內(nèi)加入誘導(dǎo)成骨分化的細(xì)胞培養(yǎng)基約2 mL。期間每隔3 d 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)液更換。誘導(dǎo)分化21 d 后，通過細(xì)胞固定液固定細(xì)胞并利用茜素紅染色5 min，最后通過顯微鏡觀察著色情況并拍照。2）成脂分化：成脂分化培養(yǎng)包括A 液和B 液兩部分處理。首先通過采用成脂分化培養(yǎng)基A 液處理細(xì)胞72 h，之后改用成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基B，處理細(xì)胞24 h，之后再次使用A液體處理細(xì)胞72 h。按照上述交替操作3～5 次，最后再次使用B 液繼續(xù)誘導(dǎo)分化3～7 d。將上述成脂誘導(dǎo)后的細(xì)胞用多聚甲醛固定后，油紅O 染色約30 min，顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.2.4 CCK-8 檢測人參皂苷Rh2 對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖 將消化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按照96 孔板密度為：1×104/孔接種，細(xì)胞貼壁生長24 h 后，實驗分為對照組、人參皂苷Rh2 低劑量組、人參皂苷Rh2 中劑量組和人參皂苷Rh2 高劑量組。其中人參皂苷組采用不同濃度（10、20、40 μmol/L）人參皂苷Rh2 處理48 h，每個濃度設(shè)置6 個復(fù)孔，每孔加入CCK-8 溶液10 μL 繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀設(shè)定波長為450 nm 檢測各孔的吸光度值，以O(shè)D 值反應(yīng)細(xì)胞的活力。[4]

1.2.5 克隆形成實驗檢測人參皂苷Rh2 對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖影響 將分離、純化得到的第3 代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)分別加入總濃度為10、20、40 μmol/L 的人參皂苷Rh2，持續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后使用PBS 清洗細(xì)胞3 次，最后采用多聚甲醛固定細(xì)胞，并用0.1%結(jié)晶紫細(xì)胞染色 10 min，PBS清洗干凈后，顯微鏡下拍照并計數(shù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞克隆數(shù)。[9]

1.2.6 CCK-8 法檢測LY294002 對人參皂苷Rh2 促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖影響 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植于6 孔板內(nèi)貼壁生長24 h 后，待其生長融合度達(dá)到70%左右時，加入p-Akt 抑制劑LY294002（20、40 μmol/L）處理4 h后，人參皂苷Rh2高劑量處理細(xì)胞48 h，最后通過CCK-8 檢測細(xì)胞活力。[5]

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot） 1）將處理完成的NPCs 放置于1.5 mL 的組織研磨管內(nèi)并按照1:4比例加入細(xì)胞裂解液放置在已經(jīng)預(yù)冷后的細(xì)胞組織勻漿儀中進(jìn)行研磨；2）4 ℃ 12 000×g 離心10 min，收集細(xì)胞上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量檢測；3）每孔上樣量為30 μg 進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳實驗，根據(jù)目的蛋白分子量大小以及蛋白marker 指示進(jìn)行切膠，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，脫脂牛奶封閉2 h，孵育對應(yīng)一抗（1:1 000）4 ℃過夜，孵育二抗（1:5 000）1～2 h，于搖床搖晃洗膜，含吐溫磷酸鹽緩沖液（TPBS）洗滌后加入ECL，使用膠片曝光，圖片掃描后用 Image J 軟件計算各條帶的灰度值，以各目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。[10]

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 原代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多呈現(xiàn)多角形和棱形，培養(yǎng)至第3 代細(xì)胞多以棱形為主并呈渦旋樣生長（圖1）。對培養(yǎng)至第3 代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化21 d后，茜素紅染色顯示大片紅色骨結(jié)節(jié)形成，表明成骨誘導(dǎo)分化成功。成脂誘導(dǎo)分化24 d 后，油紅O 染色可見明顯紅色脂滴形成，表明成脂誘導(dǎo)分化成功（圖2）。

圖1 原代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征（×200）

圖2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成脂分化（×200）

2.2 人參皂苷Rh2 對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響 CCK-8 法測定Rh2 對BMSCs 增殖的影響。見表1。

表1 Rh2 對BMSCs 細(xì)胞活力及克隆數(shù)目的影響

2.3 人參皂苷Rh2 對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞PI3K/Akt 蛋白表達(dá)的影響 為探究Rh2 對BMSCs 增殖的作用機(jī)制。Western blot 檢測了PI3K、Akt 和p-Akt 表達(dá)水平。與對照組相比，Rh2 中、高劑量組能夠顯著促進(jìn)PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)（P＜0.05 或P＜0.01）；與Rh2 低劑量組相比，Rh2 中、高劑量組PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05 或P＜0.01）；Rh2 高劑量組與Rh2 中劑量組無顯著性差異（圖3，表2）。提示：Rh2 可能通過作用于PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)BMSCs 增殖。

圖3 Rh2 對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞PI3K/Ak 蛋白表達(dá)影響

表2 相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.4 抑制PI3K/Akt 對人參皂苷Rh2 促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響 探究人參皂苷Rh2 通過PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)BMSCs 增殖。通過Akt 抑制劑LY294002（20、40 μmol/L）處理細(xì)胞后，高劑量Rh2 處理48 h 后。Western blot 檢測顯示，與Rh2 高劑量組相比，抑制劑LY294002（40 μmol/L）組PI3K、p-Akt 表達(dá)顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。CCK-8 檢測細(xì)胞活力結(jié)果顯示，與Rh2 高劑量組相比，LY294002 抑制劑（40 μmol/L）組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）（圖4，表3）。

圖4 LY294002 抑制劑對Akt 蛋白表達(dá)影響

表3 LY294002 抑制劑對Rh2 促進(jìn)BMSCs 增殖的影響

3 討論

Rh2 是人參的有效活性成分之一，具有廣泛的藥理學(xué)作用，主要包括誘導(dǎo)細(xì)胞分化或凋亡，抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖以及抗細(xì)胞炎癥等[10-11]。新近研究發(fā)現(xiàn)Rh2 能夠促進(jìn)BMSCs 的分化作用[8]。

既往也證實，BMSCs 可以通過特定條件下增殖，分化為多種功能性細(xì)胞進(jìn)而參與機(jī)體特定生物學(xué)作用，是一種有前景的治療性干細(xì)胞[12-14]。本研究首先通過對例如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及BMSCs 等貼壁能力的差異初步純化大鼠得到BMSCs。為進(jìn)一步鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs，在初步純化得到的細(xì)胞培養(yǎng)至第3 代時，對其進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成骨誘導(dǎo)分化21 d 后，茜素紅染色顯示大片紅色骨結(jié)節(jié)形成，表明成骨誘導(dǎo)分化成功。成脂誘導(dǎo)分化24 d 后，油紅O 染色可見明顯紅色脂滴形成，表明成脂誘導(dǎo)分化成功。以上結(jié)果表明，本研究成功分離得到BMSCs，為后續(xù)探究Rh2 對BMSCs 的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。為探究Rh2 對細(xì)胞增殖的影響。本研究首先設(shè)置不同濃度梯度的Rh2（2、4、8 μmol/L）處理BMSCs 48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Rh2 處理組均能顯著增加BMSCs 活力并呈現(xiàn)濃度依賴性特點。同時細(xì)胞克隆實驗也證實，Rh2 能夠顯著增加BMSCs克隆細(xì)胞數(shù)目。那么有關(guān)Rh2 對BMSCs 的分子作用機(jī)制又是如何呢？PI3K/Akt 信號通路廣泛存在于細(xì)胞中，參與了包括細(xì)胞增殖在內(nèi)的多種生物學(xué)調(diào)控過程[15-16]。磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidyl Inositol 3-Kinase，PI3K）是一類位于細(xì)胞質(zhì)中的脂類激酶。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，約含480 個氨基酸殘基，又稱蛋白激酶B[17]。PIP3 可以作為第二信使，能夠?qū)kt 募集到質(zhì)膜上，促進(jìn)Akt 發(fā)生磷酸化，繼而誘導(dǎo)下游分子信號傳導(dǎo)[18]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，Rh2 能夠通過抑制PI3K/Akt 通路，激活p53 信號通路，促進(jìn)Caspase-3 表達(dá)，導(dǎo)致Bcl-2/Bax 比例失調(diào)，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子可以通過激活PI3K/Akt 信號，促進(jìn)BMSCs 增殖和遷移[20]?；谝酝墨I(xiàn)報道，我們推測Rh2 促進(jìn)BMSCs 增殖的作用機(jī)制可能涉及PI3K/Akt 信號。通過Western blot 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Rh2 中劑量組和高劑量組均能夠促進(jìn)PI3K 和p-Akt 表達(dá)。結(jié)合細(xì)胞增殖檢測以及PI3K/Akt 蛋白表達(dá)檢測，與對照組相比，Rh2 高劑量對BMSCs 增殖作用最為明顯。為確證Rh2 是通過PI3K/Akt信號通絡(luò)促進(jìn)BMSCs增殖，通過采用p-Akt抑制劑LY294002（20、40 μmol/L）處理后結(jié)果顯示，與Rh2 高劑量組相比，40 μmol/L 的LY294002 能夠顯著下調(diào)p-Akt 表達(dá)，抑制BMSCs 增殖。

綜上所述，Rh2 能夠通過PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)BMSCs 增殖。以上研究結(jié)果將為Rh2 用于促進(jìn)BMSCs 增殖提供新的分析作用機(jī)制。