劉 波 ，王 滌，劉 穎，景 偉，楊圓圓，吳 壯，陳明星

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150000；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是新生兒在圍產(chǎn)期內(nèi)由多種原因引發(fā)的腦組織缺氧缺血，該病常常會遺留一些運動障礙、癲癇等神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重者可危及生命[1]，而致使腦部受損的其中一個關(guān)鍵原因為細(xì)胞凋亡。針康法是治療腦卒中康復(fù)的新型方法，是把頭穴叢刺法與現(xiàn)代康復(fù)治療技術(shù)聯(lián)合起來，可有效改善缺氧缺血性腦損傷患者的運動功能障礙，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及信號通路等修復(fù)損傷腦神經(jīng)[2-4]。研究表明[5]，PI3K/Akt 信號通路是缺血再灌注后引發(fā)細(xì)胞凋亡過程的重要通路，而 14-3-3 蛋白因子會在這個通路中表現(xiàn)其抗凋亡的功能。本實驗采用原位末端標(biāo)記法（TUNEL 法）、免疫組化法以及免疫印跡法（Western blot 法）來觀察針康法在不同時段對缺氧缺血性腦損傷的新生大鼠的腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及 Akt、14-3-3 蛋白表達(dá)的影響。

1 實驗材料

7 日齡新生 Wistar 大鼠（上海斯萊克），雌雄不限，質(zhì)量 11～ 15 g 。隨機(jī)分為 5 組：A 組（假手術(shù)組）、B 組（模型組）、C 組（針刺組）、D 組（康復(fù)組）和E 組（針刺加康復(fù)組），每組再分為 24 h、72 h 和7 d 3 個亞組，每組 6 只。A 和B 組均不作針刺及康復(fù)處理。5 組新生大鼠均采用相同方式喂養(yǎng)，生活環(huán)境也一致。8%O2和92%N2混合氣體（哈爾濱鼎新工業(yè)氣體）；華佗牌針灸針 0.25 mm×25 mm 無菌一次性（北京中研太和醫(yī)療器械）；2135 型切片機(jī)（德國菜卡）；轉(zhuǎn)棒疲勞儀（上海欣軟）；3000 顯微攝影成像系統(tǒng)（美國moticam）；電熱恒溫箱（上海一恒）；Fresco 低溫冷凍離心、MultiSkan3 酶標(biāo)儀（Thermo）；電泳儀（Bio-Rad）。兔抗 Akt 一抗、14-3-3 抗體（北京博奧森）；PV6001 二抗（北京中杉）；TUNEL 法檢測試劑盒（美國羅氏）；山羊抗兔 IgG（H+L），HRp、內(nèi)參抗體GAPDH 鼠單抗（天德悅）；BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天）；ECL 發(fā)光液（Millipore）。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備 新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型制備采用 Rice-vannucci 方法[6]，將大鼠用乙醚麻醉，固定于仰臥位，暴露頸部表皮，局部消毒后，沿頸部正中線剪開皮膚后分離左側(cè)頸總動脈，并采用雙結(jié)扎，術(shù)后縫合頸部表皮。再將大鼠放回窩內(nèi)，休息 2 h 后，放入有機(jī)玻璃缺氧箱內(nèi)，溫度 37 ℃，再以氣流速度為0.5 L/min 通入 8% 氧、92% 氮的混合氣體，2 h 后取出，出現(xiàn)夾尾左旋者為建模成功，納入實驗。A 組只將表皮剪開并將左側(cè)頸總動脈顯露于外，不結(jié)扎也不放入缺氧箱中，縫合后放回。

2.2 針刺及康復(fù)方法 針刺治療主要采用于致順的頭穴叢刺法[7]，穴位皮膚常規(guī)消毒后，選取百會及百會左、右側(cè)各旁開 1 mm 處針刺，用手快速捻針 1 min 后，留置 2 h，每日 1 次。康復(fù)訓(xùn)練主要予以轉(zhuǎn)籠、轉(zhuǎn)棒等康復(fù)方法。轉(zhuǎn)籠長至 1 m，直徑 0.6 m，為圓柱形網(wǎng)籠，有 4 小格，轉(zhuǎn)棒為長度 0.75 m，直徑 4.5 cm 的木棒,其兩端可用手順或逆時針旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速 5 r/min，每日均訓(xùn)練 10 min。針康組則將上述針刺和康復(fù)2 種方法同時進(jìn)行，每日 1 次。C、D 和 E 組均為術(shù)后清醒后開始相應(yīng)治療，然后分別在治療后 24 h、72 h 以及 7 d 后處死、取腦。所有新生大鼠在治療過程中無間歇。

2.3 神經(jīng)功能損傷評分 選用 Bederson 法[8]，盲評各組手術(shù)后新生大鼠的神經(jīng)功能。0 分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1 分：把鼠尾提起并遠(yuǎn)離地面，非受損側(cè)前側(cè)肢體不能進(jìn)行伸展活動；2 分：輕推位于地面的大鼠身體兩側(cè)，非受損側(cè)抗力減弱；3 分：大鼠步行時向非損傷側(cè)旋轉(zhuǎn)甚至傾倒；4 分：大鼠不能自由行走甚至無法正常站立。

2.4 腦組織采集和固定 分為兩部分，一部分是將大鼠用乙醚麻醉后，打開胸腔，剪去心臟的右心耳部位，然后從左心尖處依次注入生理鹽水和溶液 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde,PA）開始心臟灌注，直至大鼠肺臟變白，肢體強(qiáng)直時立即斷頭、取大腦，隨后立即放入 4%PA 溶液中固定。另一部分則不經(jīng)過心臟灌注，麻醉取腦后置于瓶中，隨后立即放入液氮中 5 min，最后放于-80 ℃冰箱中保存。

2.5 腦細(xì)胞凋亡的檢測 將腦組織經(jīng) 4%PA 溶液中取出，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，厚 4 μm，運用原位末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL 法）檢測試劑盒進(jìn)行處理，在400 倍顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)中的細(xì)胞，表達(dá)的陽性細(xì)胞為黃色或黃棕色或棕黑色，每只大鼠隨機(jī)選取 5張切片觀察，取平均值記錄凋亡數(shù)量。

2.6 Akt 蛋白表達(dá)的檢測 取出在 4%PA 溶液中的腦組織，脫水，石蠟包埋，然后常規(guī)脫蠟到水化，PBS沖洗后加入一抗，沖洗，再滴加二抗，沖洗，DAB 顯色 5～ 10 min。再用蘇木素染色，然后以中性樹膠為材料封片，最終置于高倍鏡下。應(yīng)用 Image-pro plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達(dá)進(jìn)行分析，以積分光密度（IOD 值）代表蛋白 Akt 相對表達(dá)量，每只鼠均隨機(jī)觀測 5 個鏡下視野，得其平均值。

2.7 14-3-3 蛋白表達(dá)的檢測 將大腦從-80 ℃冰箱內(nèi)拿出后，放入裂解液，然后進(jìn)行3次勻漿，再以 4 ℃離心，13 000 r/20 min，離心完成后取上清，用 BCA 法將蛋白定量，上樣量為 20 μg/孔，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、染色后，封閉 30 min。加入 14-3-3（1:1 000）一抗，孵育10 min，放 4 ℃過夜。加入山羊抗兔 IgG（H+L）HRp（1:10 000）二抗，室溫輕搖 40 min。洗膜后把 ECL 發(fā)光液加到膜上等候，再顯影 2 min 后，最終進(jìn)行掃描。內(nèi)參 GAPDH 鼠單抗（1:20 000）檢測過程與目標(biāo)蛋白相同。運用 Gel-Pro-Analyzer 4.0 分析條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/GAPDH 鼠單抗條帶灰度值為該樣本目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 不同時間點各組 Bederson 評分比較 見表 1。

表1 不同時間點各組 Bederson 評分比較（，n =6）

表1 不同時間點各組 Bederson 評分比較（，n =6）

注：與 A 組比較，## P ＜0.01；與 B 組比較，△P ＜ 0.05；與 C組比較，▲P ＜0.05；與 D 組比較，□P ＜0.05

3.2 不同時間點各組腦凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較 見表 2。

表2 不同時間點各組腦凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較（，n =6） （個/400 倍）

表2 不同時間點各組腦凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較（，n =6） （個/400 倍）

注：與 A 組比較，## P ＜0.01；與 B 組比較，△△P ＜0.01；與 C組比較，▲P ＜0.05；與 D 組比較，□P ＜0.05

3.3 不同時間點各組腦組織 Akt、14-3-3 蛋白表達(dá)比較 見表 3、表 4。

表3 不同時間點各組腦組織 Akt 蛋白表達(dá)比較（，n =6）

表3 不同時間點各組腦組織 Akt 蛋白表達(dá)比較（，n =6）

注：與 A 組比較，# P ＜0.05；與 B 組比較，△P ＜0.05；與 C 組比較，▲P ＜0.05；與 D 組比較，□P ＜0.05

4 討論

針刺療法可改善腦缺血部分的神經(jīng)元的缺損情況，促使神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)；康復(fù)技術(shù)能激發(fā)缺血區(qū)周圍的神經(jīng)突觸再生，使非缺血區(qū)的功能逐漸提高[9]。而針康法則是將二者聯(lián)合起來，即在頭穴叢刺法的留針其間，同時開始各類康復(fù)鍛煉，這是一個醫(yī)治腦卒中的臨床新型途徑。臨床研究表明，針康法可治療腦卒中后期所致的肌張力增高或肌力下降等運動功能障礙、患肢偏癱等多種并發(fā)癥，提高患者生活質(zhì)量[10]。而許多基礎(chǔ)研究表明，針康法可保護(hù)已損傷的腦組織，幫助軸突重塑，使神經(jīng)功能恢復(fù)；促進(jìn)或抑制某些相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡數(shù)量；促進(jìn)腦損傷后血管新生，幫助損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)，改善腦部的血流量等功能[11]。本研究表明，針康法能有效改善腦損傷新生大鼠的神經(jīng)功能損傷。有研究證明，PI3K/Akt 信號通路對細(xì)胞的生長、發(fā)育以及凋亡等過程均起到重要的調(diào)節(jié)作用[12]，該通路通過阻止細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而改善缺氧缺血性腦損傷。PI3K 是一種磷脂酰肌醇激酶，其主要作用是活化 Akt（又稱蛋白激酶 B），而 Akt作為抗凋亡調(diào)節(jié)因子，可顯著影響著細(xì)胞的存活。Bcl-2 家族對細(xì)胞凋亡也有明顯的調(diào)節(jié)作用，它包含了以 Bcl-2、Bcl-xl 為主的抗凋亡因子與作用相反的、以Bad 為主的促凋亡因子[13-14]。細(xì)胞在缺氧缺血受損的條件下，可激活 PI3K，進(jìn)而使 Akt 磷酸化，被激活后的 Akt 又可使促凋亡蛋白 Bad 磷酸化，并與 14-3-3 蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，這就使得抗凋亡蛋白 Bcl-2/Bcl-xl與 Bad 分開，并在細(xì)胞質(zhì)中游離，從而發(fā)揮其作用[15]。本次研究提示針康法能提高 Akt、14-3-3 蛋白活性，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡，使得腦部的神經(jīng)功能逐步恢復(fù)。

表4 不同時間點各組腦組織 14-3-3 蛋白表達(dá)比較（，n =6）

表4 不同時間點各組腦組織 14-3-3 蛋白表達(dá)比較（，n =6）

注：與 A 組比較，## P ＜0.01；與 B 組比較，△P ＜0.05；與 C組比較，▲P ＜0.05；與 D 組比較，□P ＜0.05

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞死亡過程，具有主動性和有序性，過程中有許多基因與蛋白因子參與，而能否表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡在于促凋亡和抗凋亡因子的對抗結(jié)果，所以在有效的時間內(nèi)調(diào)控這些因子從而阻止細(xì)胞凋亡對神經(jīng)功能的恢復(fù)有重大意義[16-18]。本次研究說明針康法可有效減少缺氧缺血性腦損傷大鼠的細(xì)胞凋亡數(shù)，降低腦組織損傷。