張?zhí)毂?，彭飛燕，吳 瑕，盛囝靖，陳國(guó)忠

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州西溪醫(yī)院，杭州 310023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530001；3.東陽(yáng)市中醫(yī)院，浙江 東陽(yáng) 322100；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023）

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，抑制結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移且誘導(dǎo)其凋亡是提高臨床療效的關(guān)鍵[1-2]。自研究發(fā)現(xiàn)腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象以來(lái)，雖幾經(jīng)研究干預(yù)治療，然腫瘤多藥耐藥所導(dǎo)致的化療失敗，依舊是腫瘤治療中存在的難點(diǎn)[3]。七方胃痛顆粒對(duì)胃惡性腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用，且未見(jiàn)明顯毒副作用[4-5]。本研究旨在探討七方胃痛顆粒對(duì)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株Caco-2 的影響，為今后七方胃痛顆粒防治結(jié)腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株Caco-2 獲購(gòu)于上?；鄯f生物科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；七方胃痛顆粒方藥組成：由紅參10 g，白術(shù)10 g，生黃芪30 g，茯苓10 g，炙甘草9 g，白芍30 g，炒雞內(nèi)金9 g，枳實(shí)10 g，木香6 g，黃連6 g，吳茱萸3 g，丹參6 g，免煎中藥顆粒（國(guó)藥準(zhǔn)字 Z20123053）由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，顆粒被混合攪勻并按每袋8 g 的規(guī)格滅菌包裝，實(shí)驗(yàn)前稱取所需劑量藥物[6]。實(shí)驗(yàn)大鼠20 只，平均體質(zhì)量（96±10）g，購(gòu)于湖南長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，用于制備藥物血清。四甲基偶氮唑鹽 （MTT）（sigma,美國(guó)）；流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD,C6）；流式細(xì)胞檢測(cè)所用的試劑盒（美國(guó)BD,556547）；DMEM 高糖培養(yǎng)基及胰蛋白酶（Gibco,1505-065,美國(guó)）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermofisher,Multiscan FC,美國(guó)） ；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（thermo,美國(guó)）。

2 方法

2.1 細(xì)胞株與菌株的培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株Caco-2 置于內(nèi)含10%的胎牛血清、100 mg/L 鏈霉素及10 萬(wàn) U/L 的青霉素DMEM 培養(yǎng)基，放置于CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，箱內(nèi)設(shè)置為37 ℃常溫。

2.2 藥物血清制備 將大鼠隨機(jī)分為七方胃痛顆粒藥物血清組和空白對(duì)照組各10 只，按成人用藥體重劑量比值，將中藥換算為50 g/kg 的濃度，繼而給藥物血清組的大鼠灌胃，連續(xù)灌服5 d；空白對(duì)照組的大鼠則予灌服與藥物血清組等體積的生理鹽水，連續(xù)灌服5 d。灌胃結(jié)束后2 h，大鼠腹主動(dòng)脈采血，分離血清，56 ℃滅活，使用0.22 μm 微孔過(guò)濾除菌，分裝保存。

2.3 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法 實(shí)驗(yàn)分為5 組，A組：空白對(duì)照組，B 組：加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的七方胃痛顆粒藥物血清，C 組：加入體積分?jǐn)?shù)為5.0%的七方胃痛顆粒藥物血清，D 組：加入體積分?jǐn)?shù)為10.0%的中藥藥物血清，E 組：加入體積分?jǐn)?shù)為20.0%的中藥藥物血清。分別作用于細(xì)胞株24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 液 20 μL，培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4 h 后，每孔加入150 μL 的二甲基亞楓溶液，避光震蕩15 min，使結(jié)晶物充分融化，并在調(diào)至波長(zhǎng)為490 nm的酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光值（OD 值）。并以下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1－實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值）×100%。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）實(shí)驗(yàn) 在6 孔板中接種耐藥細(xì)胞株Caco-2，于孔板中孵育24 h 后，各等份Caco-2細(xì)胞加入下列組別中，B 組（體積分?jǐn)?shù)為2.5%的中藥藥物血清）、C組（體積分?jǐn)?shù)為5.0%的中藥藥物血清）、D 組（體積分?jǐn)?shù)為10.0%的中藥藥物血清）、E 組（體積分?jǐn)?shù)為20.0%的中藥藥物血清），另設(shè)空白對(duì)照組A 組。實(shí)驗(yàn)給藥方法與MTT 檢測(cè)相同，培養(yǎng)48 h 后，分別收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇固定24 h，并用胰蛋白酶消化，收集制成細(xì)胞懸液；檢測(cè)前細(xì)胞懸液用 PBS 洗滌2 次，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀液，加入150 μL RNA 酶A（0.1 mg/mL）和120 μL 碘化丙啶，保持在舒適的室溫下避光孵育15 min；然后將細(xì)胞懸液混勻，用尼龍膜過(guò)濾細(xì)胞管過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢凋亡細(xì)胞率。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 16.0 軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述和分析，采用單因素方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 七方胃痛顆粒抑制細(xì)胞株Caco-2 增殖的作用 見(jiàn)表1。

3.2 七方胃痛顆粒誘導(dǎo)細(xì)胞株Caco-2 凋亡的作用 見(jiàn)表2。

表1 七方胃痛顆粒不同濃度藥物血清對(duì)Caco-2 細(xì)胞抑制率的比較（） %

表1 七方胃痛顆粒不同濃度藥物血清對(duì)Caco-2 細(xì)胞抑制率的比較（） %

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與A 組、B 組比較，△P ＜0.05；與A 組、B 組、C 組比較，▲P ＜0.05；與A 組、B 組、C 組、D 組比較，□P ＜0.05

表2 各組人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞Caco-2 凋亡率的比較（）%

表2 各組人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞Caco-2 凋亡率的比較（）%

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與A 組、B 組比較，△P ＜0.05；與A 組、B 組、C 組比較，▲P ＜0.05；與A 組、B 組、C 組、D 組比較，□P ＜0.05

4 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,手術(shù)和放、化療雖然是目前治療該病的主要方法,然而其毒副作用、耐藥性等問(wèn)題尚未得到根本解決[7-8]。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤療效肯定，毒副作用小，具有整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)[9]，其治療機(jī)制通過(guò)調(diào)節(jié)臟腑氣血，糾正機(jī)體陰陽(yáng)失衡，改善人體內(nèi)在環(huán)境，來(lái)達(dá)到抗腫瘤的效果[10]。七方胃痛顆粒為全國(guó)名老中醫(yī)羅偉生教授臨證治療胃腸疾病的經(jīng)驗(yàn)方，由四君子湯、左金丸、逍遙散、丹參飲、枳術(shù)丸、枳實(shí)芍藥散、木香檳榔丸合方而成，主要藥物組成為紅參、黃芪、茯苓、白術(shù)、炙甘草、丹參、木香、黃連、吳茱萸、白芍、枳實(shí)、炒雞內(nèi)金，具有健脾益氣、活血化瘀、清利濕熱、理氣止痛等功效[11-18]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，七方胃痛顆粒可以抑制人胃癌SGC-7901 細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]。

Li 等研究表明，Caco-2 細(xì)胞來(lái)源于人體的結(jié)、直腸癌細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)Caco-2 細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的增殖，可以達(dá)到抗結(jié)腸癌的作用及其具有預(yù)防癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效果[19]。研究結(jié)果表明，七方胃痛顆粒對(duì)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株Caco-2 有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，并能誘導(dǎo)Caco-2 細(xì)胞凋亡，且與藥物血清濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)性。