王道猛 錢 斌 孟陽春 何小勇

肺癌是全世界發(fā)病率及死亡率均位于首位的惡性腫瘤[1-2]，肺癌的臨床分型主要分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌約占80%[3]。在我國非小細胞肺癌仍是威脅人民健康的頭號殺手，因此肺癌的防治工作仍是一項重要的關(guān)系民生的艱巨任務(wù)，目前非小細胞肺癌的治療方式主要是以手術(shù)為主的多學科綜合治療，雖然提高了一部分病人的生存率，但總體生存率仍不容樂觀，因為大多數(shù)肺癌出現(xiàn)癥狀去就診時已處于中晚期，已發(fā)生了癌細胞的增值及遷徙[4]，因此從基因水平探討肺癌的發(fā)生發(fā)展機制及與臨床預后的關(guān)系，為肺癌的個體化治療提供科學的依據(jù)是目前研究的熱點之一。

FOXM1(叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1)編碼的蛋白質(zhì)是參與細胞增殖的轉(zhuǎn)錄激活因子，編碼的蛋白質(zhì)在M期磷酸化并調(diào)節(jié)幾種細胞周期基因的表達，例如細胞周期蛋白B1和細胞周期蛋白D1。目前的研究表明FOxMl基因的過表達與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[5-8]，如肝癌、食管鱗癌、前列腺癌，肺癌等。

Oncomine數(shù)據(jù)庫是目前全球最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)平臺，在該數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)收集了715個基因的表達數(shù)據(jù)，86 733個腫瘤組織和正常組織的樣本數(shù)據(jù)。我們可以選擇自己感興趣的研究基因，在不做實驗的情況下，薈萃分析自己感興趣的基因與預后的關(guān)系。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫的基因表達及預后的挖掘，薈萃分析有利于增加說服力及提供客觀的依據(jù)，本研究薈萃FOXM1和非小細胞肺癌預后關(guān)系，為進一步研究FOXM1在非小細胞肺癌發(fā)生增值遷徙中的作用機制提供線索和依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

在 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中挖掘相關(guān)信息具體過程如下：在此數(shù)據(jù)庫中可根據(jù)自己的感興趣的基因及腫瘤類型設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件。本研究中首先選擇的篩選條件是：①Cancer Type：lung cancer；②Gene：FOXM1；③Data Type：mRNA 或 DNA；④Analysis type： cancer vs normal analysis；⑤臨界值設(shè)定條件(P值<1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%)。

二、Kaplan-Meier Plotter分析患者生存情況

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫是一個可以分析目標基因與腫瘤預后相關(guān)性的數(shù)據(jù)庫。我們通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫選擇FOXM1基因分析肺癌的生數(shù)據(jù)，觀察目標基因與肺癌的預后關(guān)系。篩選條件如下：①“Cancer: Lung Cancer”；②“Gene: FOXM1”； ③“Survival: OS”。

三、統(tǒng)計學方法

利用t檢驗比較非小細胞肺癌與正常肺組織中FOXM1基因表達差異。利用Kaplan-Meier曲線進行生存分析FOXM1基因表達與患者生存的關(guān)系，不同組之間生存率的比較采用Log-Rank檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、FOXM1在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤類型中的表達差異情況。

在所示的圖中我們可以看到Oncomine 數(shù)據(jù)庫總共收集到455項有關(guān)FOXM1在不同癌癥中的研究分析，其中關(guān)于FOXM1表達的研究結(jié)果有78項具有統(tǒng)計學差異。 其中FOXM1高表達的研究75 項，低表達降的研究3項。

二、FOXM1在非小細胞肺癌中的表達情況

通過提取Oncomien數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，2001年來共有11項研究12個數(shù)據(jù)集共包括1 178個樣本涉及FOXM1在非小細胞非癌組織及正常組織之間表達的比較。組織學類型包括非小細胞肺癌的主要病理類型與正常組織比較。文章分別發(fā)表于Nat Med(2002)、Proc Natl Acad Sci USA(2001)、PLoS One(2010)、PLoS One(2008)、Cancer Res(2012)、Genome Res(2012)、Am J Pathol(2005)、BMC Genomics(2007)、Cancer Res(2005)、Sci Transl Med(2010)和TCGA。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫中薈萃分析進一步了解到，與正常組織相比，F(xiàn)OXM1基因在全部差異表達的基因中位數(shù)值排名為392.0，P=0.002，研究揭示FOXM1在非小細胞肺癌中呈現(xiàn)出高表達的狀態(tài)。

三、進一步分析FOXM1在不同的研究中非小細胞肺癌和正常肺組織的表達差異情況

通過每一個芯片基因研究分析發(fā)現(xiàn)：利用箱式圖比較發(fā)現(xiàn)FOXM1基因在不同的非小細胞肺癌研究芯片中均呈高表達，與正常組織相比顯著增高(P<1E-4)。

在這12個數(shù)據(jù)集中，有9項研究顯示FOXM1在非小細胞肺癌癌組織與正常組織表達差異有統(tǒng)計學意義，分別是SuLung[9](t=7.030，P=2.05E-9)，Garber Lung[10](t=7.273，P=3.83E-6 )，Beer Lung[11](t=8.092，P=2.07E-7)，Stearman Lung[12](t=6.747，P=1.01E-7 )，Hou Lung[13](t=9.640，P=1.05E-13)，Hou Lung(t=7.301，P=3.23E-7)，Landi Lung[14](t=8.572，P=6.82E-13)，Selamat Lung[15](t=9.550，P=7.25E-14)，Okayama Lung[16](t=7.233，P=4.60E-8)，其余3項研究差異無統(tǒng)計學意義(t=1.062，1.376；P>0.05)

四、FOXM1基因表達量與非小細胞肺癌患者生存的關(guān)系

FOXM1表達量與非小細胞肺癌預后關(guān)系究竟如何，我們通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫我們輸入目標基因及腫瘤名稱繪制生存曲線分析發(fā)現(xiàn)FOXM1的表達量的高低與患者的總體生存率(overall survival, OS)有顯著的關(guān)系。高表達組患者的總體生存率顯著降低(HR=2.02，P<1E-16，圖1A)。表達越高患者的總體生存率越差，表達越低患者的預后越好。分析結(jié)果揭示FOXM1表達量與非小細胞肺癌患者的預后相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)FOXM1表達量在肺腺癌和肺鱗癌中后預后仍有顯著的相關(guān)性：在肺腺癌患者中我們發(fā)現(xiàn)FOXM1高表達水平對總體生存率有顯著影響(HR=2.4，P<1E-16， 圖1B)，在肺鱗癌患者中同樣我們可以發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)論，其高表達水平對總體生存率有顯著的影響(HR=1.33，P=0.018，圖1C)。

討 論

目前肺癌是全世界發(fā)病率及死亡率均位于首位的惡性腫瘤，肺癌的臨床分型主要分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌約占80%。在我國非小細胞肺癌仍是威脅人民健康的頭號殺手，因此肺癌的防治工作仍是一項重要的關(guān)系民生的艱巨任務(wù)，目前非小細胞肺癌的治療方式主要是以手術(shù)為主的多學科綜合治療，雖然提高了一部分患者的生存率，但總體生存率仍不容樂觀，因為大多數(shù)肺癌出現(xiàn)癥狀去就診時已處于中晚期，已發(fā)生了癌細胞的增值及遷徙，因此急需從基因?qū)用嫣接懛伟┑陌l(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲的機制及與臨床特征。總體生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)新的有指導臨床治療及預后意義的基因，為肺癌的個體化治療提供科學的依據(jù)是目前研究的熱點。

FOXM1起源于叉頭基因家族，它是細胞周期重要的調(diào)節(jié)因子[17]。FOXM1對于胚胎發(fā)育至關(guān)重要，F(xiàn)OXM1主要在增殖細胞中表達或由生長因子釋放誘導。是典型的增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其刺激細胞增殖并表現(xiàn)出增殖特異性表達模式。在DNA合成前期、合成期和有絲分裂期表達顯著增強，F(xiàn)OXM1通過促進進入S期和M期來刺激細胞周期進展。而且FOXM1是正確執(zhí)行有絲分裂所必需的。FOXM1靶基因編碼具有執(zhí)行DNA復制和有絲分裂功能的蛋白質(zhì)。在這種情況下，F(xiàn)OXM1在大多數(shù)腫瘤中充當原癌基因并且異常表達或突變導致腫瘤細胞的增殖，遷移和侵襲[18]。目前的研究表明FOXMl基因的過表達與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[19-21]，如肝癌、食管鱗癌、前列腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌等。最近的研究已經(jīng)將FOXM1視為肺癌的新型生物標志物之一，因為它不僅刺激細胞的增殖和生長，而且還與肺腫瘤細胞的高DNA復制率有關(guān)，許多研究評估了FOXM1的過表達與非小細胞肺癌患者生存的預后因素。但是研究結(jié)果尚無定論，尚未達成共識。因此我們在Oncomine數(shù)據(jù)庫中薈萃分析FOXM1在非小細胞肺癌中的表達與臨床預后關(guān)系。

Oncomine數(shù)據(jù)庫是目前全世界最大的基因芯片平臺，可以利用非營利性郵箱注冊，在該數(shù)據(jù)庫中薈萃分析不同腫瘤與目標基因的關(guān)系。本文充分利用該數(shù)據(jù)庫的資源，利用研究同一目標基因不同研究者的數(shù)據(jù)增加樣本量，在大樣本量的前提下提高該研究結(jié)論的可信度及增加準確性。本研究首先通過Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘FOXM1基因在頭頸部癌，肝癌，肺癌，乳腺癌等常見腫瘤中的表達信息，結(jié)果顯示在Oncomine 數(shù)據(jù)庫總共收集到455 項關(guān)于FOXM1不同腫瘤中的研究，其中關(guān)于FOXM1表達的研究結(jié)果有78項具有統(tǒng)計學差異。 其中FOXM1高表達的研究75項，低表達降的研究3項。研究表明FOXM1在常見腫瘤中處于高表達狀態(tài)與Carter等[22-23]的研究結(jié)果是一致的。進一步利用Oncomine數(shù)據(jù)庫對肺癌相關(guān)研究進行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，2001年來共有11項研究12個數(shù)據(jù)集共包括1 178個樣本涉及FOXM1在非小細胞非癌組織及正常組織之間表達的比較。組織學類型包括非小細胞肺癌的常見病理類型與正常組織的比較。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫中薈萃分析深入挖掘進一步了解到，與正常的肺組織相比，F(xiàn)OXM1基因在全部差異表達的基因中位數(shù)值排名為392.0，P=0.002，研究揭示FOXM1在非小細胞肺癌中呈現(xiàn)出高表達的狀態(tài)。

圖1 FOXM1表達量與非小細胞肺癌預后關(guān)系；注：A：NSCLC(n=1 926)；B：adenocarcinoma(n=720)；C：squamous cell carcinoma(n=524)

KM Plotter數(shù)據(jù)庫是目前全球比較通用的腫瘤生存相關(guān)的在線分析數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫可以分析18 000多個癌癥樣本評估54 000多個基因?qū)ι媛实挠绊?。其中包?00余例乳腺癌、1 800余例卵巢癌、2 400余例肺癌、360余例肝癌等相關(guān)的生存數(shù)據(jù)。在該數(shù)據(jù)庫中我們可以分析54 000多個基因與2 400余例肺癌的生存狀況，而且可以對肺鱗癌和肺腺癌進行亞組分析。本研究發(fā)現(xiàn)在KM plotter 數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù)揭示FOXM1與非小細胞肺癌的預后關(guān)系可見FOXM1表達量與非小細胞肺癌的預后顯著相關(guān)。在研究中可見 FOXM1的表達量對患者的總體生存率(overall survival, OS)有顯著的影響。低表達量的非小細胞肺癌預后顯著好于高表達量的非小細胞肺癌預后 (HR=2.02，P<1E-16，圖1A)。以上結(jié)果顯示FOXM1表達量是非小細胞肺癌患者預后不良因素之一。我們在該數(shù)據(jù)庫中進一步分析FOXM1表達量與肺腺癌和肺鱗癌的預后關(guān)系表明：在肺腺癌患者中，F(xiàn)OXM1高表達量對生存率有明顯的影響(HR=2.4，P<1E-16， 圖1B)，同樣的數(shù)據(jù)提取方法，我們發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌患者中，其高表達量對對生存率有明顯的影響作用 (HR=1.33，P=0.018，圖1C)。但仍需要增加樣本量，通過分子生物學技術(shù)在蛋白和分子水平上對FOXM1在不同非小細胞肺癌組織類型中的表達水平及作用機制進行進一步分析驗證。發(fā)現(xiàn)FOXM1通過何種通路調(diào)控非小細胞的增值侵襲作用，F(xiàn)OXM1有可能成為判斷非小細胞肺癌預后的一個潛在生物標志物

綜上所述，我們通過Oncomine數(shù)據(jù)庫對FOXM1在非小細胞肺癌組織中表達的相關(guān)信息挖掘，我們拖過研究認為FOXM1在非小細胞肺癌組織中高表達，且與非小細胞肺癌預后相關(guān)。表達越高，患者的預后越差。利用數(shù)據(jù)庫進行大樣本分析，可以避免小樣本研究產(chǎn)生的誤差，F(xiàn)OXM1的表達與非小細胞肺癌的預后呈正相關(guān)。FOXM1有可能成為判斷非小細胞肺癌預后的一個潛在生物標志物。FOXM1在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制，仍需實驗來進一步研究。