郭新宇，田鵬，張鵬，劉毅，劉健康

河南省人民醫(yī)院阜外華中心血管病醫(yī)院普外科，鄭州 450000

胃癌是發(fā)病率和病死率均較高的腫瘤之一，發(fā)病早期癥狀缺乏特異性，導致早期診斷率明顯較低，但進展期胃癌患者的預后明顯差于早期胃癌，因此，尋找影響胃癌預后的風險因素十分重要[1-2]。叉頭框蛋白 C1（forkhead box C1，F(xiàn)OXC1）家族龐大且功能廣泛，DNA結合區(qū)域有特殊的翼狀螺旋結構是其結構特點，已有研究證實，F(xiàn)OX參與調控機體免疫、糖和脂類代謝、細胞周期和凋亡并保持胚胎干細胞的多功能性[3-4]。FOX家族成員之一的FOXC1被證實與腫瘤細胞的增殖、浸潤轉移密切相關，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[5]。上皮鈣粘蛋白（E-cadherin）是鈣依賴鈣粘著素家族成員之一，主要分布于非神經(jīng)細胞的上皮組織，主要功能是介導同種細胞間的黏附[6]。早期研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin黏附系統(tǒng)可明顯抑制腫瘤轉移，破壞多種惡性腫瘤的黏附功能，導致腫瘤細胞離散從而發(fā)生侵襲和遠處轉移[7]。目前，關于FOXC1和E-cadherin在胃癌臨床預后中的相關性及對腫瘤細胞生物學行為的影響的報道較少，因此，本研究探討FOXC1、E-cadherin在胃癌中的表達及與患者臨床特征和預后的關系，并分析FOXC1、E-cadherin對胃癌細胞增殖、侵襲的影響及作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年3月至2014年3月在河南省人民醫(yī)院胃腸外科一個病區(qū)手術治療的97例胃癌患者。納入標準：病理學診斷證實為胃癌；癌旁正常組織距離腫瘤邊緣外2 cm以上且經(jīng)病理學證實未發(fā)生癌變。排除標準：合并其他惡性腫瘤的患者；術前接受放化療、免疫治療或其他治療。97例胃癌患者中男50例，女47例；年齡38～80歲，平均（55.16±10.43）歲；＜50歲41例，≥50歲56例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期64例；病理類型均為腺癌；分化程度：低分化65例；中分化21例，高分化11例；淋巴結轉移74例，未轉移23例；腫瘤直徑：≥3 cm 69例，＜3 cm 28例；浸潤深度：未及漿膜層24例，突破漿膜層73例。取97例胃癌患者的胃癌組織及相應的癌旁正常組織標本。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準通過，所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞和主要試劑 胃癌細胞系SGC7901和人永生化正常胃黏膜細胞系GES-1均購自中國科學院（上海）細胞庫，干擾質粒pLVTHM-shFOXC1及陰性對照pLVTHM-shNC均由上海吉瑪公司設計并完成，Anti-FOXC1抗體-ChIP Grade（山羊多克隆抗體 to FOXC1-ChIP Grade，ab5079）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的驢抗山羊IgG、Anti-E-cadherin抗體（兔多克隆抗體to E-cadherin，ab15148）、HRP標記的山羊抗兔IgG均購自美國Abcam公司，通用二步法檢測試劑盒（PV9000）及二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（ZLI-9018）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組化法檢測FOXC1、E-cadherin的表達情況 取胃癌組織及相應癌旁正常組織樣本固定包埋并切片，常規(guī)脫蠟和水化后，置于檸檬酸鹽緩沖液中高壓修復，采用3%雙氧水室溫下浸泡以阻斷內源性過氧化物酶，封閉，分別加入稀釋好的FOXC1、E-cadherin一抗4℃過夜孵育，次日復溫后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌干凈，分別加入稀釋好的HRP標記的驢抗山羊IgG、山羊抗兔IgG，室溫孵育30 min，PBS洗滌。加入適量DAB孵育5 min，去離子水終止反應，蘇木素復染，自來水沖洗后依次梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡透明后干燥，中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果。

結果判定：由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師對病理切片進行盲評。每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野隨機計數(shù)200個細胞，以細胞出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達，依據(jù)染色強度及陽性細胞比例進行評分。染色強度計分：無著色計0分，淡黃色染色計分，棕黃色染色計2分，棕褐色染色計3分。陽性細胞所占比例計分：無陽性細胞計0分，＜25%計1分，25%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。將染色強度和陽性細胞所占比例評分相加，≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.2.3 穩(wěn)定干擾細胞系建立 將對數(shù)生長期的293FT細胞消化后加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，均勻鋪至6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達70%時換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。采用Lipofectamine 2000轉染試劑并參照說明書，分別將干擾質粒pLVTHM-shFOXC1及陰性對照pLVTHM-shNC轉染至293FT細胞，48 h后收獲慢病毒液，分別感染備好的SGC7901細胞，48 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），將構建成功的穩(wěn)定干擾細胞系分別記為SGC7901-shFOXC1和SGC7901-shNC，同時設置SGC7901空白對照。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測細胞中FOXC1、E-cadherin的相對表達量 分別提取空白對照SGC7901、人永生化正常胃黏膜細胞系GES-1、穩(wěn)定干擾細胞系SGC7901-shFOXC1及陰性對照SGC7901-shNC的總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒測定含量。加入上樣緩沖液后煮沸以制備蛋白樣品，取適量加入配制好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠，電泳后轉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，加入含5%脫脂奶粉的封閉液室溫下孵育2 h。分別加入適量用封閉液稀釋的FOXC1、E-cadherin一抗，4℃冰箱過夜。次日復溫后加入PBST洗膜，分別加入適量稀釋好的HRP標記的驢抗山羊IgG、山羊抗兔IgG，室溫震蕩孵育2 h，PBST洗膜后加入電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）避光5 min，暗室曝光并拍照，同時以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）作為內參蛋白，計算FOXC1、E-cadherin的相對表達量。

1.2.5 平板克隆實驗檢測細胞增殖能力 將空白對照SGC7901、人永生化正常胃黏膜細胞系GES-1、穩(wěn)定干擾細胞系SGC7901-shFOXC1及陰性對照SGC7901-shNC細胞消化后，接種于6孔板，每孔5×103，輕輕混勻后繼續(xù)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔周更換新鮮培養(yǎng)液，2周后用考馬斯亮藍染色，并在顯微鏡下計數(shù)菌落形成數(shù)量。重復實驗3次，取平均數(shù)。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 將基質膠Matrigel用無血清1640培養(yǎng)基以1∶5進行稀釋，并取50 μl加入每個Transwell小室中，37℃靜置待其凝固后使用。實驗前12 h將細胞培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)基，消化細胞后用滅菌PBS清洗并計數(shù)，加入無血清培養(yǎng)基重懸細胞使其密度為5×105/ml，取250 μl加入至Transwell小室中，下室中加入600 μl含10%胎牛血清的1640，并保證下室與Transwell小室間無氣泡產生。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后棄掉Transwell小室中培養(yǎng)液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定下室面，PBS洗滌后，室溫下加入0.1%結晶紫染液避光染色15 min，用棉簽將小室上層未遷移細胞輕輕擦掉，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下取5個高倍視野觀察，并計數(shù)穿過基質膠的細胞數(shù)。重復實驗3次取平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或秩和檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗；相關分析采用Spearman相關分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中FOXC1和E-cadherin表達情況的比較

胃癌組織中FOXC1蛋白的陽性表達率為74.23%（72/97），高于癌旁正常組織的42.27%（41/97），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=20.039，P＜0.05）。胃癌組織中E-cadherin蛋白的陽性表達率為29.90%（29/97），低于癌旁正常組織的100%（97/97），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=104.698，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中FOXC1和E-cadherin表達情況的比較

不同性別、年齡胃癌患者胃癌組織中FOXC1、E-cadherin蛋白陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低中分化、淋巴結轉移、腫瘤直徑≥3 cm、基層浸潤深度突破漿膜層胃癌患者胃癌組織中FOXC1蛋白陽性表達率較高、E-cadherin蛋白陽性表達率較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

2.3 胃癌患者胃癌組織中FOXC1和E-cadherin表達的相關性

Spearman相關分析結果顯示，胃癌患者胃癌組織中FOXC1表達與E-cadherin表達呈負相關（r=-0.645，P=0.000）。

2.4 預后情況的比較

以電話或定期門診復查的方式對97例胃癌患者進行5年的隨訪，隨訪截止時間為2019年3月31日，總生存期（overall survival，OS）指從手術開始至患者死亡或隨訪結束的時間。結果顯示，F(xiàn)OXC1陽性表達患者的5年生存率為56.94%，低于陰性患者的88.00%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.862，P＜0.05）；E-cadherin陽性表達患者的5年生存率為100%，高于陰性患者的50.00%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=22.325，P＜0.05）。FOXC1陰性 E-cadherin陽性患者5年生存率最高，為100%；其后依次為FOXC1和E-cadherin均陰性、FOXC1和E-cadherin均陽性，分別為80.00%、77.78%；FOXC1陽性E-cadherin陰性患者的5年生存率最低，為50.79%。

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中FOXC1和E-cadherin表達情況的比較

2.5 不同細胞系中FOXC1和E-cadherin表達情況的比較

空白對照SGC7901、陰性對照SGC7901-shNC細胞中FOXC1蛋白的相對表達量均高于人永生化正常胃黏膜細胞系GES-1，E-cadherin蛋白的相對表達量均低于人永生化正常胃黏膜細胞系GES-1，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；穩(wěn)定干擾細胞系SGC7901-shFOXC1中FOXC1蛋白的相對表達量低于空白對照SGC7901和陰性對照SGC7901-shNC，E-cadherin蛋白的相對表達量高于空白對照SGC7901和陰性對照SGC7901-shNC，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖1、表2）

圖1 Western blot檢測不同細胞系中FOXC1和E-cadherin的表達情況

2.6 FOXC1表達對胃癌細胞株SGC7901增殖能力的影響

平板克隆實驗結果顯示，穩(wěn)定干擾細胞系SGC7901-shFOXC1細胞克隆數(shù)為（186±46），明顯低于空白對照SGC7901的（895±204）和陰性對照SGC7901-shNC細胞的（884±226），差異均有統(tǒng)計學 意 義（t=7.581、6.767，P＜0.01）；空 白 對 照SGC7901和陰性對照SGC7901-shNC細胞克隆數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.081，P=0.937）。

表2 不同細胞系中FOXC1和E-cadherin蛋白的相對表達量（±s）

注：a與人永生化正常胃黏膜細胞系GES-1比較，P＜0.05；b與空白對照SGC7901比較，P＜0.05；c與陰性對照SGC7901-shNC比較，P＜0.05

細胞系FOXC1蛋白E-cadherin蛋白GES-1 SGC7901 SGC7901-shNC SGC7901-shFOXC1 F值P值0.09±0.031.68±0.32 0.67±0.15a0.18±0.09a 0.72±0.17a0.17±0.08a 0.24±0.08b c1.35±0.24b c 19.99342.409 0.0000.000

2.7 FOXC1表達對胃癌細胞株SGC7901侵襲能力的影響

Transwell實驗結果顯示，穩(wěn)定干擾細胞系SGC7901-shFOXC1通過Matrigel基質膠的數(shù)量為（46±13），明顯少于空白對照SGC7901的（176±57）和陰性對照SGC7901-shNC的（186±64），差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.972、4.794，P＜0.01），空白對照SGC7901和陰性對照SGC7901-shNC通過Matrigel基質膠的數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.261，P=0.800）。

3 討論

轉錄因子是一類通過調控特定的靶基因，對細胞、組織及器官的生長發(fā)育、分化、代謝等生物學過程發(fā)揮作用的關鍵性蛋白。存在于低等生物至高等生物中具有廣泛功能的FOX是一類龐大的轉錄因子家族成員，因其DNA結合區(qū)域存在特殊的翼狀螺旋結構，即“叉頭區(qū)”，因此，被稱為叉頭框轉錄因子。目前，已發(fā)現(xiàn)不同種屬中從A～S等19個亞組共100多個FOX家族成員[8-9]。研究顯示，作為叉頭框轉錄因子家族成員之一，F(xiàn)OXC1參與了多種生物學過程，其基因遺傳突變與胚胎發(fā)育異常密切相關[10-11]；此外，F(xiàn)OXC1還可促進卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤的進展，其過渡表達嚴重影響患者的預后[12-14]。本研究結果顯示，F(xiàn)OXC1在胃癌組織中高表達，可能作為促癌分子參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。此外，TNM分期越高、分化程度為低中分化、淋巴結轉移、腫瘤直徑越大、組織浸潤程度越深，F(xiàn)OXC1陽性表達率越高，表明FOXC1與腫瘤的惡性程度呈正相關，且促進了胃癌的侵襲和轉移。

作為黏附分子家族成員之一，E-cadherin在鈣離子參與下具有維持細胞間黏附連結、組織上皮完整性的作用，E-cadherin基因本身因具有跨膜結構特征而能參與細胞信號轉導[15]。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與多種實體腫瘤侵襲及轉移的重要過程，其基本特征為E-cadherin基因缺失或表達下調，這主要是因為E-cadherin基因功能障礙可破壞腫瘤細胞間的黏附功能，從而使腫瘤細胞易于脫離原發(fā)灶并發(fā)生轉移[16-17]。諸多腫瘤相關的研究結果顯示，E-cadherin蛋白表達下調增強了惡性腫瘤的侵襲能力，使患者預后較差[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中E-cadherin蛋白的陽性表達率低于癌旁正常組織，表明E-cadherin在胃癌組織中呈低表達且發(fā)揮抑癌基因的作用。此外，TNM分期越晚、分化程度為低中分化、淋巴結轉移、腫瘤直徑越大、組織浸潤越深，胃癌患者胃癌組織中E-cadherin的陽性表達率越低，表明E-cadherin與腫瘤的惡性程度呈負相關，且抑制胃癌的侵襲轉移。

Spearman結果顯示，胃癌患者胃癌組織中FOXC1表達與E-cadherin表達呈負相關（r=-0.645，P=0.000）。預后情況顯示，F(xiàn)OXC1陽性表達患者的5年生存率低于陰性表達患者，E-cadherin陽性表達患者的5年生存率高于陰性表達患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步證實FOXC1促進胃癌進展且不利于患者預后，E-cadherin則與FOXC1相反，抑制胃癌利于患者良好預后。

本研究成功構建了穩(wěn)定干擾細胞FOXC1細胞系，以進一步研究FOXC1和E-cadherin在胃癌細胞中的相關性及其作用機制。結果顯示，空白對照SGC7901、陰性對照SGC7901-shNC細胞中FOXC1蛋白的相對表達量均高于人永生化正常胃黏膜細胞系GES-1，E-cadherin蛋白的相對表達量均低于人永生化正常胃黏膜細胞系GES-1，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與組織檢測結果相一致。SGC7901-shFOXC1細胞中，F(xiàn)OXC1基因被敲低而表達下調，表明穩(wěn)轉干擾細胞系構建成功，同時，E-cadherin表達上調，提示E-cadherin的表達能被FOXC1抑制，再次證實二者呈負相關性。研究顯示，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，可能存在FOXC1基因表觀遺傳學的改變，F(xiàn)OXC1基因可能是通過調控細胞周期蛋白cyclin D1的表達影響細胞增殖[19-20]。本研究的平板克隆實驗表明，敲低FOXC1的表達后，SGC7901細胞克隆數(shù)明顯減少，說明FOXC1蛋白能促進胃癌細胞增殖。Transwell實驗表明，敲低FOXC1的表達后，SGC7901細胞通過Matrigel基質膠的數(shù)量明顯減少，說明FOXC1蛋白能增強胃癌細胞的侵襲能力。

綜上所述，胃癌組織中FOXC1呈高表達，E-cadherin呈低表達，二者呈負相關；FOXC1通過促進胃癌細胞增殖、抑制E-cadherin表達來促進EMT進程，從而提高胃癌細胞的侵襲能力，最終導致胃癌的發(fā)生發(fā)展并影響患者的預后。