古麗米娜

（新疆塔城地區(qū)疾病預(yù)防控制中心，新疆 塔城 834700）

0 引言

本文著重介紹了在流感檢測(cè)中常用的分子檢測(cè)技術(shù)包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

1 分子檢測(cè)技術(shù)

近年來(lái)，分子生物學(xué)的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，流感病毒的檢測(cè)技術(shù)變得更加成熟和多樣化。除納米技術(shù)，核酸探針技術(shù)，基因測(cè)序技術(shù)，原位雜交技術(shù)，質(zhì)譜法等外，本文主要介紹了聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)，核酸序列依賴性擴(kuò)增，環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增和基因芯片檢測(cè)技術(shù)。目前在中國(guó)預(yù)防和監(jiān)測(cè)流感病毒中使用最廣泛的是聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法。

1.1 聚合酶鏈反應(yīng)。通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)流感病毒主要是通過分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，該技術(shù)是通過在很短的時(shí)間內(nèi)添加大量特異性DNA片段實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的檢測(cè)。在具體的檢測(cè)過程中，聚合酶鏈反應(yīng)只需要少量樣品就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)流感的檢測(cè)。并且重復(fù)性好，檢測(cè)速度快，靈敏高效。從收集樣本到最終檢測(cè)結(jié)果至少需要2個(gè)小時(shí)，最多需要24個(gè)小時(shí)。聚合酶鏈反應(yīng)方法包括常用的RT-PCR方法，多重RT-PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量方法。其中，常見的RT-PCR方法主要檢測(cè)NA基因片段和HA基因片段，目前檢測(cè)未知流感。通過合并引物對(duì)病毒的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，以達(dá)到分型的目的。多重RT-PCR方法一次只能檢測(cè)一種病毒，也可以同時(shí)檢測(cè)多種病毒，但是必須應(yīng)用多對(duì)引物組合來(lái)進(jìn)行類型檢測(cè)。它還具有高靈敏度和特異性，高檢測(cè)效率以及用于檢測(cè)多種病毒的低成本夜店，所以更適合于臨床檢測(cè)應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法是將熒光基因添加到聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)中，并通過在檢測(cè)過程中實(shí)時(shí)積累熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，從而進(jìn)行定量分析。該方法不僅具有普通聚合酶鏈反應(yīng)方法的特異性強(qiáng)，靈敏度高和可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，而且由于可以更直觀地檢測(cè)熒光因子，因此大大降低了檢測(cè)假陽(yáng)性的可能性。

1.2 依賴核酸序列的擴(kuò)增法（NASBA）。依賴核酸序列的擴(kuò)增方法的檢測(cè)敏感性和特異性高于通過聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)的方法。并且擴(kuò)增效率更高并且操作相對(duì)簡(jiǎn)單。但是，該方法必須在檢測(cè)之前優(yōu)化引物。也有一些病毒在檢測(cè)病毒時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性或敏感性不足。它主要由一對(duì)引物引導(dǎo)連續(xù)的特異性單鏈RNA進(jìn)行恒定溫度擴(kuò)增以產(chǎn)生反應(yīng)。依靠核酸序列的擴(kuò)增方法被廣泛用于流感病毒檢測(cè)和呼吸道病毒檢測(cè)。目前，醫(yī)學(xué)研究界改進(jìn)了NASBA檢測(cè)技術(shù)。目前NASBA檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量檢測(cè)。大大提高了其檢測(cè)的特異性和靈敏度。它已被廣泛用于檢測(cè)甲型和乙型流感病毒和呼吸道病毒，并可以快速分離出乙型，H3N2和H1N1流感病毒[1]。

1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）是一種擴(kuò)增核酸的方法。具體方法是將四種特異性引物與恒定溫度下的DNA聚合酶的置換結(jié)作用，實(shí)現(xiàn)靶基因上多個(gè)區(qū)域的核酸擴(kuò)增。該方法操作簡(jiǎn)便，不需要特殊的試劑和儀器。LAMP檢測(cè)只有兩個(gè)結(jié)果，一個(gè)是擴(kuò)增，另一個(gè)是沒有擴(kuò)增，只需要檢查反應(yīng)物的顏色和試劑的濁度即可判斷結(jié)果。目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)非常成熟，并開發(fā)了多種針對(duì)性的檢測(cè)技術(shù)，如新型H1N1流感病毒檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)，季節(jié)性流感病毒的檢測(cè)技術(shù)，H3N2病毒的檢測(cè)技術(shù)[2]。

1.4 基因芯片。其測(cè)序原理是一種雜交測(cè)序方法，通過與一組已知的核酸探針雜交來(lái)確定核酸序列。并將具有已知序列的靶核苷酸的探針固定在基片表面上。通過將探針與樣品雜交并檢測(cè)雜交信號(hào)來(lái)確定生物樣品的數(shù)量?；蛐酒瑱z測(cè)的穩(wěn)定性高，重復(fù)性和并行性好，檢測(cè)速度快，效率高。唯一的缺點(diǎn)是操作繁瑣，特別是對(duì)于測(cè)試設(shè)備和其他條件的要求較高，難以適用于一般實(shí)驗(yàn)室的病毒檢測(cè)。但對(duì)于調(diào)查流行病學(xué)和進(jìn)行醫(yī)學(xué)科學(xué)研究非常有效[3]。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

檢測(cè)流感病毒的最常見方法通常是分離病毒和鑒定病毒。細(xì)胞培養(yǎng)的方法可用于分離流感病毒，從而確保流感病毒與原始標(biāo)本的抗原性處于一致狀態(tài)，這對(duì)于長(zhǎng)期保存以及更好地分析病毒抗原性和基因是有利的。然而，細(xì)胞培養(yǎng)方法存在一些缺陷，主要是因?yàn)閺钠渲蟹蛛x出的病毒不能用于疫苗生產(chǎn)，并且細(xì)胞培養(yǎng)方法的檢測(cè)率容易受到待檢測(cè)病毒載量樣品的質(zhì)量影響。如果樣品質(zhì)量不夠高或病毒載量不足，則容易產(chǎn)生假陰性的情況。

同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)方法適用于對(duì)活體病毒的檢測(cè)，因此該檢測(cè)方法需要在收集和保存標(biāo)本的過程中確保病毒的活性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是傳統(tǒng)PCR技術(shù)不斷發(fā)展出的一類新技術(shù)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)控核酸的拷貝數(shù)。這一技術(shù)具有高靈敏度和快速檢測(cè)速度的特點(diǎn)。在檢測(cè)過程中受到污染的影響，檢測(cè)結(jié)果比較精準(zhǔn)。已廣泛用于病毒病原體的檢測(cè)[4]。

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）可用于擴(kuò)增特定核苷酸片段的指數(shù)級(jí)數(shù)。在擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳定性分析，可以使用放射性核素進(jìn)行標(biāo)記后使用光密度掃描。并采取定量分析措施進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)任務(wù)。實(shí)時(shí)定量PCR主要是實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)當(dāng)中的每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào)。在此過程中，從最初的模板到最后的信號(hào)收集都要進(jìn)行定量和定性分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物將繼續(xù)進(jìn)行。隨著熒光信號(hào)數(shù)量的增加，熒光信號(hào)的強(qiáng)度也會(huì)增加。在每個(gè)循環(huán)中，都能收集到各個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。從而可以根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化觀察產(chǎn)物量的變化，從而繪制熒光擴(kuò)增曲線圖。用于提取病毒RNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法的檢測(cè)方法耗時(shí)約3小時(shí)，并且對(duì)流感病毒具有高特異性。與血清診斷和特異性抗體檢測(cè)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法可以鑒定多種流感病毒株，并且特異性和敏感性都較高，這有助于盡快診斷出此類患者的具體疾病[5-6]。

3 病原學(xué)檢測(cè)方法

3.1 病毒分離與鑒定。分離和鑒定病毒是對(duì)流感的經(jīng)典診斷方法。最常用的方法是細(xì)胞接種和雞胚接種。根據(jù)細(xì)胞源性病變，雞胚死亡或培養(yǎng)的尿囊液具有凝集性紅細(xì)胞的特征作為判斷的基礎(chǔ)進(jìn)行鑒定。針對(duì)NP的單抗體，也可以用于通過免疫熒光染色對(duì)病毒進(jìn)行初步鑒定。診斷還需要其他輔助測(cè)試方法。這一測(cè)試方法的結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，敏感。但是，操作過程復(fù)雜，成本高，實(shí)驗(yàn)室要求高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，周期長(zhǎng)，檢測(cè)時(shí)間需要1-3周，對(duì)于大面積的應(yīng)用受到了相當(dāng)?shù)南拗啤?/p>

3.2 電鏡檢測(cè)技術(shù)。流感病毒可以通過電子顯微鏡或免疫電子顯微鏡診斷。在電子顯微鏡下可以清楚地觀察到病毒的形態(tài)，以確定病毒的存在與否。電子顯微鏡檢測(cè)快速，準(zhǔn)確，但測(cè)試結(jié)果與樣品制備技術(shù)，取材位置和時(shí)間有關(guān)。而且該方法不能用于確定亞型和致病性。

4 免疫學(xué)檢測(cè)

4.1 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)。HA和HI檢測(cè)簡(jiǎn)單，快速，但操作繁瑣且耗時(shí)，并且無(wú)法用已知HA亞型的抗血清檢測(cè)出新的流感HA亞型。HI檢測(cè)是WHO在全球流感監(jiān)測(cè)中使用的一種流行方法。通常首先將可疑疾病材料接種到適當(dāng)年齡細(xì)胞中以進(jìn)行病毒分離，然后使用培養(yǎng)物檢測(cè)培養(yǎng)物是否具有血凝素活性，然后使用已知的陽(yáng)性抗體進(jìn)行HI試驗(yàn)血清驗(yàn)證。

4.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）。AGP測(cè)試用于檢測(cè)甲型流感病毒特異性血清抗體，適用于鑒定所有甲型流感病毒。AGP測(cè)試很簡(jiǎn)單，可以定性和定量檢測(cè)。但是，這一方法靈敏度差并且容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。已經(jīng)基于AIV快速定型雙擴(kuò)散法建立了AGP診斷試劑盒。

4.3 乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）。LAT是一種聚苯乙烯乳膠顆粒，可作為吸附特定抗原或抗體的載體。當(dāng)遇到血清中的相應(yīng)抗體或處理過的材料中的相應(yīng)抗原成分時(shí)，會(huì)形成較大的聚集顆粒。乳膠凝集試驗(yàn)簡(jiǎn)單，快速，不需要昂貴的設(shè)備和操作技能。由于被LAT識(shí)別的IgM抗體是人體產(chǎn)生最早的一種抗體，因此LAT更適合早期診斷。

4.4 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NIT）。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)基于甲型流感病毒表面抗原神經(jīng)氨酸酶的特征來(lái)鑒定流感病毒。Van Deuson R A等人改進(jìn)了恒定NIT測(cè)試方法，以建立平板微NIT方法。該方法不僅減少了抗原的數(shù)量，而且同時(shí)對(duì)多個(gè)分離株進(jìn)行處理。世界衛(wèi)生組織已推薦該方法用于神經(jīng)氨酸酶亞型的分類。

4.5 病毒中和試驗(yàn)（NT）。NT檢測(cè)是最經(jīng)典的血清學(xué)方法之一。只有當(dāng)抗體與病毒體上的表面抗原相對(duì)應(yīng)時(shí)，特別是當(dāng)抗體與吸附在宿主細(xì)胞上的病毒抗原相對(duì)應(yīng)時(shí)，測(cè)試才能獲得令人滿意的結(jié)果。因此，NT檢測(cè)是最靈敏，最特異性的血清學(xué)檢測(cè)方法，檢出率也很高，但操作繁瑣，耗時(shí)。

4.6 免疫熒光技術(shù)（IFA）。免疫熒光法是在抗體上標(biāo)記不影響抗原抗體活性的熒光染料，并在與相應(yīng)的抗原結(jié)合后在熒光顯微鏡下表現(xiàn)出特定的熒光反應(yīng)的方法，包括直接熒光抗體方法和間接熒光抗體方法。后者更為常見。IFA是劇透高度特異性和敏感性的，可用于鑒定和定位感染流感病毒的細(xì)胞中的特定抗原，主要是核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原。然而，抗原的制備需求較高高，結(jié)果判斷的客觀性不足，并且假陽(yáng)性的發(fā)生概率高，因此，這僅僅只能作為一種篩選方法使用。

4.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。ELISA法運(yùn)用酶標(biāo)記抗原或抗體，并通過顯色反應(yīng)檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原，并且可以進(jìn)行定性和定量確定。ELISA方法的靈敏度和特異性與被包被的抗原或抗體的純度直接相關(guān)，高于常規(guī)方法的AGP測(cè)試和HAI測(cè)試，并且檢測(cè)需要的時(shí)長(zhǎng)也更短?？梢詫?shí)現(xiàn)抗原檢測(cè)和抗體檢測(cè)。目前，已經(jīng)建立了流感病毒重核蛋白ELISA方法和流感抗體斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）檢測(cè)方法[7-8]。

4.8 側(cè)流免疫測(cè)定（LFA）。LFA技術(shù)的檢測(cè)原理是乳膠珠或膠體金的抗原-抗體復(fù)合物橫向遷移，直到在固定表面（膜支持物）上遇到抗體為止，結(jié)合后可以通過肉眼觀察到一系列的反應(yīng)。LFA具有快速分析的優(yōu)勢(shì)，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢查。

4.9 膠體金免疫層析法（GICA）。GICA使用免疫層析原理將抗原或單克隆抗體固定在層析介質(zhì)上。通過毛細(xì)管脈沖使待測(cè)樣品的抗原或抗體脈沖化，然后在結(jié)合后保留在該區(qū)域中，并根據(jù)膠體金法官進(jìn)行免疫色譜反應(yīng)。GICA是一種快速簡(jiǎn)便的方法，可在15～30分鐘內(nèi)獲得診斷。它具有不需要實(shí)驗(yàn)設(shè)備，可用視覺判斷，試劑用量少，穩(wěn)定性強(qiáng)和重復(fù)性好，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。適用于現(xiàn)場(chǎng)快速初步篩選。缺點(diǎn)是對(duì)流感的檢測(cè)靈敏度低，易漏檢或出現(xiàn)假陽(yáng)性，不易量化，不便于大規(guī)模的密集操作[9-10]。

4.10 壓電生物傳感器檢測(cè)儀。該技術(shù)采用戊二醛交聯(lián)法，將流感H抗原固定于銀電極表面，制成多通道的壓電免疫傳感器，判定標(biāo)準(zhǔn)為檢測(cè)陽(yáng)性樣品的響應(yīng)值與陰性樣品的噪聲值之比＞3，可用于AIV的定性定量檢測(cè)。生物傳感器靈敏度高、響應(yīng)快，不需要標(biāo)記，可同步進(jìn)行流感病毒的定性定量和分型診斷檢測(cè)，具有高靈敏度、小體積、快速、低成本、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)。

5 結(jié)論

綜上所述，在流感檢測(cè)工作中，目前較為常見的檢測(cè)技術(shù)為分子檢測(cè)技術(shù)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法，在流感的檢測(cè)和疾病控制工作中發(fā)揮了重要的作用。