賈孝娟 張巍巍 李文利 姜大磊 謝方瑜 張一 付來(lái)琳 王堯 陳斌 宋敏 李靜 解祥軍

1青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)科，青島 266011；2青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院心內(nèi)科，青島 266011；3青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院肝膽外科，青島 266011；4青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院內(nèi)窺鏡室，青島 266011

PDAC是胰腺癌中最常見(jiàn)的亞型，占所有胰腺腫瘤的85%[1]。由于胰腺位置隱匿，早期癥狀不典型[2]，近80%的患者在確診前就已發(fā)生局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此識(shí)別潛在敏感的生物標(biāo)志物對(duì)PDAC早期診斷至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，PDAC患者血清中存在miRNAs表達(dá)譜的異常，且比蛋白質(zhì)標(biāo)志物出現(xiàn)得更早，提示循環(huán)miRNAs可能對(duì)PDAC的早期診斷具有重要意義[3-4]。miR-224-5p(miR-224)是miRNAs家族的一員，可作為結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌等診斷的替代和無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物之一[5-6]。文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]，PDAC組織的miR-224-5p異常高表達(dá)，且常出現(xiàn)于PDAC的早期。本研究檢測(cè)PDAC患者血清miR-224-5p表達(dá)，探討其對(duì)胰腺癌早期臨床診斷的價(jià)值。

資料與方法

一、一般資料

收集青島市市立醫(yī)院2018年8月至2020年4月間收治的40例PDAC患者。其中男性25例，女性15例，年齡(64±9)歲。按第8版AJCC分期將患者分為早期PDAC組(11例)和中晚期PDAC組(29例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理資料完整；EUS-FNA或手術(shù)切除術(shù)后組織及細(xì)胞病理檢查確診為PDAC。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性胰腺炎及PDAC癌前病變；有其他惡性腫瘤病史；伴有急性感染、肝炎、冠心病、腦梗死等嚴(yán)重疾??；采集血樣前患者接受過(guò)手術(shù)、化放療、介入等其他治療。

收集同期21例慢性胰腺炎患者作為胰腺良性疾病對(duì)照組，其中男性10例，女性11例，年齡(61±8)歲。招募體檢的40名健康志愿者作為健康對(duì)照組(無(wú)肝膽或胰腺疾病史、無(wú)其他系統(tǒng)疾病、無(wú)惡性疾病)，其中男性19例，女性21例，年齡(61±7)歲。慢性胰腺炎患者及健康對(duì)照者與PDAC患者在年齡、性別等方面具有可比性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

所有入組對(duì)象抽血前3 d限制脂肪、蛋白等飲食，采集外周靜脈血3 ml，離心后取上清液，移入2 ml無(wú)RNA酶的EP管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Trizol試劑(北京天根生化科技有限公司)提取血清總RNA，紫外分光光度法測(cè)定樣本總RNA的濃度和純度，A260/280在1.8～2.1之間。應(yīng)用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(廣州復(fù)能基因有限公司，QP013)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成 cDNA。采用定量PCR試劑Green Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司，RR820A)配制反應(yīng)混合液。然后把加好樣品的96孔板放在ABI 7500型熒光定量PCR儀中進(jìn)行qPCR反應(yīng)。miR-224-5p正向引物序列為5′-TCAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAG-3′，反向引物序列為5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；內(nèi)參U6正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，共循環(huán)40次。由儀器自帶軟件獲取樣本Ct值，按照公式2-△△Ct計(jì)算miR-224-5p相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)管，取均值。

CA19-9檢測(cè)試劑購(gòu)自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，上全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Roche)cobas 8000檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、PDAC組與慢性胰腺炎組及健康對(duì)照組血清miR-224-5p水平比較

早期PDAC組、中晚期PDAC組、慢性胰腺炎組和健康對(duì)照組血清miR-224-5p水平分別為3.21(2.01，4.60)、4.70(3.50，8.26)、1.72(1.02，2.78)、1.38(0.89，2.11)，中晚期PDAC組血清miR-224-5p水平顯著高于早期PDAC組，早期PDAC組又顯著高于慢性胰腺炎組和健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而慢性胰腺炎組與健康對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、miR-224-5p、CA19-9診斷PDAC的臨床價(jià)值

血清miR-224-5p、CA19-9診斷PDAC及早期PDAC的靈敏度、特異度的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-224-5p聯(lián)合CA19-9診斷PDAC的總靈敏度為92.5%～95.0%，高于CA19-9(P值分別為0.037、0.046)，對(duì)早期PDAC的診斷靈敏度為90.0%～90.9%，略低于總靈敏度，但高于單CA19-9(P值分別為0.044、0.041)及miR-224-5p(P值分別為0.038、0.023)；特異度為71.4%～72.5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從高到低，3者對(duì)PDAC及早期PDAC的診斷靈敏度依次為miR-224-5p+CA19-9、miR-224-5p、CA19-9，特異度依次為CA19-9、miR-224-5p、miR-224-5p+CA19-9(表1、圖1)。

表1 miR-224-5p、CA19-9診斷胰腺導(dǎo)管腺癌的受試者工作特征曲線分析

圖1 miR-224-5p、CA19-9診斷PDAC、早期PDAC的受試者工作特征曲線。1A PDAC組比健康對(duì)照組；1B PDAC組比慢性胰腺炎組；1C 早期PDAC組比健康對(duì)照組；1D 早期PDAC組比慢性胰腺炎組

三、PDAC患者血清miR-224-5p水平與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

PDAC患者血清miR-224-5p表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤位置及大小無(wú)顯著相關(guān)性(P值均>0.05)，而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(表2)。

討 論

PDAC侵襲性高、進(jìn)展性快，預(yù)后極差。目前診斷PDAC較為可靠的循環(huán)標(biāo)志物為血清CA19-9[10]，但其靈敏度60%～90%，特異度68%～ 91%，假陰性及假陽(yáng)性率較高，作為早期檢測(cè)標(biāo)志物的價(jià)值有限[11]。microRNAs是一類由19～23個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，參與細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)代謝和腫瘤發(fā)展等生理和病理過(guò)程[12]。它們具有高度保守性、特殊穩(wěn)定性和組織特異性，易于在體液中獲得。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-224-5p是一種致癌miRNA，在胃癌[13]、結(jié)直腸癌[14]、肝癌[15]、食管鱗癌[16]等消化系統(tǒng)腫瘤的表達(dá)明顯高于非腫瘤組織。Mazza等[17]、Vila-Navarro等[18]報(bào)道PDAC高表達(dá)miR-224-5p。高侵襲性和轉(zhuǎn)移性PDAC組織的miR-224-5p表達(dá)顯著增高[7-8]。miR-224-5p可通過(guò)直接靶向下調(diào)PDAC細(xì)胞表面CD40蛋白表達(dá)，增強(qiáng)PDAC的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]；通過(guò)抑制PDAC細(xì)胞Aspc-1和BxPC3的生長(zhǎng)、侵襲和遷移，增加細(xì)胞早期凋亡[8]；通過(guò)直接與其3′-非翻譯區(qū)結(jié)合而逆向調(diào)節(jié)相互作用蛋白TXNIP，激活誘導(dǎo)因子HIF1α，從而促進(jìn)PDAC的惡性進(jìn)展[19]。近來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)，miR-224-5p可靶向抑制前蛋白轉(zhuǎn)化酶PCSK9誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞BON-1凋亡[20]，miR-224-5p作為區(qū)室特異性調(diào)節(jié)劑，在PDAC細(xì)胞基質(zhì)中及癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，從而誘導(dǎo)了激活的表型、促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[9]。上述研究表明miR-224-5p參與了PDAC的發(fā)生和發(fā)展，且有望通過(guò)靶向相關(guān)基因和途徑成為PDAC潛在的治療靶點(diǎn)[21]。

表2 胰腺導(dǎo)管腺癌患者血清miR-224-5p水平與臨床病理特征的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，PDAC患者血清miR-224-5p水平較慢性胰腺炎患者及健康對(duì)照者顯著上調(diào)，且診斷靈敏度高于CA19-9，可作為PDAC診斷的循環(huán)生物標(biāo)志物。通過(guò)進(jìn)一步評(píng)估對(duì)早期PDAC診斷價(jià)值，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合檢測(cè)的診斷靈敏度高于單獨(dú)CA19-9或miR-224-5p，特異度與單獨(dú)miR-224-5p或CA19-9檢測(cè)相似，提示miR-224-5p聯(lián)合CA19-9檢測(cè)對(duì)早期PDAC診斷有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果還顯示，PDAC患者血清miR-224-5p水平與腫瘤TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P值均<0.05)，提示血清miR-224-5p可能在PDAC細(xì)胞的增殖和遷移中起重要作用。

綜上所述，miR-224-5p在PDAC患者尤其是在早期PDAC患者血清水平明顯上調(diào)，miR-224-5p或聯(lián)合CA19-9診斷價(jià)值優(yōu)于單獨(dú)CA19-9檢測(cè)，且血清樣本容易獲取，因此miR-224-5p可能作為PDAC早期診斷的一項(xiàng)敏感的循環(huán)生物標(biāo)志物。本研究不足之處為樣本量較小，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突