馬彩霞 陳鏡龍 陸 泳 張明智 王立波 陸愛珍

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院兒科（上海 201700）；2.復旦大學附屬兒科醫(yī)院（上海 201102）

肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）在兒童發(fā)病率逐年增高，近年來肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）引起的危重病例不斷增多[1-3]。在危重病例中，混合感染發(fā)生率可達30%～60%，混合感染的病原體有細菌、病毒和其他非典型病原體[4-5]。因此，早期診斷混合感染對治療重癥MPP、改善其預后有重要意義。近年來，基于宏基因組的二代測序（metagenomics nextgeneration sequencing，mNGS）技術(shù)作為病原微生物的快速檢測手段，在重癥和疑難病例的病原學診斷中發(fā)揮了重要作用。本文采用mNGS技術(shù)檢測兒童重癥MPP患兒肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的病原微生物，探討mNGS技術(shù)對兒童重癥MPP混合感染的診斷價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象

2019年6月至2019年12月期間復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院兒科和復旦大學附屬兒科醫(yī)院因重癥MPP需要肺泡灌洗治療的患兒為研究對象。所有入選患兒血清MP-IgM陽性或鼻咽分泌物MP-DNA陽性，且臨床符合重癥MPP診斷標準[6-7]。①明顯氣促或心動過速。判斷標準：＜ 1歲，呼吸頻率≥50次/min，心率≥150次/min；1～ 5歲，呼吸頻率≥ 40次/min，心率≥140次/min；＞ 5歲，呼吸頻率≥30次/min，心率≥120次/min，伴或不伴動脈血壓下降（收縮壓≤75 mmHg）、三凹征及發(fā)紺等。②規(guī)范應用大環(huán)內(nèi)酯類藥物1周以上無效，腋溫≥ 38.5 ℃ 或肺部影像學無好轉(zhuǎn)甚至進展，或持續(xù)發(fā)熱時間≥10天。③胸部影像學表現(xiàn)為大片狀致密影，占據(jù)一個肺段或肺葉以上范圍，可累及單葉或多葉病變。④出現(xiàn)胸腔積液、肺不張、肺壞死/肺膿腫等肺內(nèi)并發(fā)癥。⑤出現(xiàn)嚴重低氧血癥（PaO2＜60 mmHg）或合并其他系統(tǒng)嚴重損害（中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、心力衰竭、心肌炎、消化道出血、明顯電解質(zhì)/酸堿平衡紊亂等）。符合上述標準中前3條中的任意2條和/或后2條中任意1條診斷為重癥MPP。排除標準：①患有慢性基礎(chǔ)性疾病。②近期使用免疫制劑的患者。③T-SPOT陽性的患兒。收集研究對象的一般人口學資料、臨床資料和影像學資料。本研究得到復旦大學青浦中山醫(yī)院和復旦大學附屬兒科醫(yī)院科研倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 支氣管肺泡灌洗和BALF收集 重癥MPP是支氣管肺泡灌洗的適應證[8]。支氣管鏡檢查由經(jīng)驗豐富的醫(yī)師操作。在咪達唑侖靜脈鎮(zhèn)靜下，經(jīng)鼻進鏡，使用2%的利多卡因氣道黏膜表面麻醉。到達病變部位時，將支氣管鏡末端楔入病變段或肺葉，經(jīng)氣管鏡工作通道注入溫熱生理鹽水（1 mL/kg）進行灌洗，灌洗后立刻抽吸，抽吸壓力為100 mmHg，將回吸收的BALF吸收至痰液收集器中[9]。留取收集到的BALF 3 mL置于-80 ℃冰箱保存，待送檢迪飛醫(yī)學進行mNGS病原檢測。剩余BALF常規(guī)送檢驗科進行呼吸道病原抗原9項檢測（呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1-3型、流感病毒A、B型、偏肺病毒、鼻病毒、沙眼衣原體DNA和肺炎支原體DNA）、BALF培養(yǎng)、真菌GM試驗及抗酸染色涂片。

1.2.2 mGNS檢測 收集到的BALF行mNGS病原微生物基因檢測。核酸抽提按照TIANamp Micro DNA Kit（天根生物，北京）試劑盒說明書進行。分別采用Qubit 2.0（ThermoFisher，美國）和NanoDrop（Thermo Fisher，美國）對核酸進行定量和質(zhì)量評估。文庫構(gòu)建按照KAPA Hyper Prep kit（KAPA Biosystems，美國）試劑盒說明書進行。采用Agilent 2100 Bioanalyzer（安捷倫，美國）進行文庫質(zhì)控，最終在Illumina NextSeq 550 Dx（Illumina，美國）平臺上進行75 bp單端測序。高通量測序的原始數(shù)據(jù)通過去除低質(zhì)量堿基，接頭序列，重復序列和短序列（＜36 bp）獲得優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)。每例樣本進行不少于20M reads的高通量測序。優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)通過Bowtie 2比對人參考基因組去除人源宿主序列。剩余未比對到人參考基因組的數(shù)據(jù)通過比對微生物數(shù)據(jù)庫進行鑒定。迪感康微生物數(shù)據(jù)庫覆蓋細菌、真菌、支原體、病毒和寄生蟲，基因組序列來源于National Center Biotechnology Information （ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/）。mNGS檢測的陽性標準：①對于分枝桿菌、諾卡菌和嗜肺軍團菌，mNGS檢測到的菌種特異性序列數(shù)≥1為陽性。②對于細菌（不包括分枝桿菌、諾卡菌和嗜肺軍團菌）、真菌、支原體、病毒和寄生蟲，mNGS檢測到不重疊的特異性序列數(shù)≥3為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）表示。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗。兩變量間相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共納入47例重癥MPP患兒，其中5例由復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院兒科轉(zhuǎn)入復旦大學附屬兒科醫(yī)院呼吸科。納入患兒中，男23例、女24例，中位年齡58.0（38.0～81.0）月。影像學有肺實變/不張表現(xiàn)的患兒31例，胸腔積液10例，伴有縱隔積氣2例。氣管鏡下有明顯黏膜壞死、通氣不良或者痰栓形成的患兒28例。見表1、圖1。

表1 重癥MPP患兒臨床特點

圖1 氣管鏡下病變

2.2 病原檢測結(jié)果

47例患兒BALF傳統(tǒng)病原檢測中，細菌培養(yǎng)均為陰性；抗酸染色均為陰性；傳統(tǒng)病原檢測中所有患兒MP-PCR檢測陽性；有2例檢測出混合感染，分別為鼻病毒和腺病毒，混合感染率為4.3%。mNGS檢測中，所有患兒Mp檢測均為陽性，23例檢測出混合感染，mNGS的混合感染檢出率為48.9%，顯著高于傳統(tǒng)病原檢測，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=24.03，P＜0.001）。

對于MP檢測，傳統(tǒng)檢測中PCR方法與mNGS檢測陽性結(jié)果完全相符。傳統(tǒng)PCR的MP拷貝數(shù)1×106（1×104～1×107）與mNGS中的MP read讀數(shù)5 408（211～19 739）存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.439，P=0.002）。

mNGS檢測出的23例混合感染中，病原微生物前3位分別為腺病毒7型11例（23.4%）、肺炎鏈球菌5例、膿腫分枝桿菌5例。見表2。

表2 混合感染中病原微生物組成

3 討論

臨床上重癥MPP雖經(jīng)規(guī)范大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗MP治療，但臨床癥狀及肺部影像學改善不明顯，常常出現(xiàn)肺不張、胸腔積液，甚至發(fā)生閉塞性細支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合征，或伴有血液系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)等肺外并發(fā)癥[6]，病程遷延，影響患兒生活質(zhì)量。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是治療MP的傳統(tǒng)手段，但重癥病例單純應用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療效果不佳[10-11]。研究表明，MP黏附于氣道上皮細胞表面后，會反復持續(xù)損傷氣道纖毛柱狀上皮，造成纖毛數(shù)量減少和結(jié)構(gòu)異常，導致黏液纖毛系統(tǒng)清除功能受損，不能有效清除病原，致使肺部感染遷延不愈，容易同時合并細菌或病毒等感染[12-13]，是導致重癥病例單純應用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素效果不佳的重要原因。因此，診斷和控制混合感染是治療重癥MPP的重要途徑。

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法陽性率僅為10%左右，而傳統(tǒng)PCR檢測雖然在靈敏度、特異度和檢測時效上明顯優(yōu)于培養(yǎng)法，但因為PCR法基于已知病原菌的基因組序列，所能提供的信息有限，依然不能解決臨床診斷陽性率低的問題[14]。因此，對于混合感染和未知致病微生物的檢測是傳統(tǒng)檢測方法無法逾越的障礙。無偏倚的mNGS能克服傳統(tǒng)病原檢測的局限性，進行病原體廣譜檢測，包括細菌、病毒、真菌和寄生蟲[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在MP診斷方面，mNGS和傳統(tǒng)PCR方法完全一致，陽性率均為100%，傳統(tǒng)PCR的MP拷貝數(shù)與mNGS中的MP讀數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，考慮主要是檢測方法原理相似，兩者都采用了基因擴增技術(shù)。而在混合感染診斷方面，mNGS混合感染檢出率（48.9%），顯著高于常規(guī)病原檢測方法（4.3%），提示mNGS在混合感染的病原微生物診斷方面有強大優(yōu)勢。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，mNGS技術(shù)可以早期確定重癥肺炎患者的病原體，指導抗菌藥物的使用，從而顯著降低重癥肺炎患兒的28天和90天病死率[16]。

相關(guān)研究回顧性分析難治性MPP患兒的病原體構(gòu)成特征，對18例患兒的BALF采用mNGS進行細菌檢測，綜合臨床特征判斷18例患兒的其他細菌檢出結(jié)果為陰性，得出難治性MPP患兒混合細菌感染很少見的結(jié)論[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，重癥MPP患兒的BALF中存在混合細菌，肺炎鏈球菌和膿腫分枝桿菌是檢出率較高的兩種菌，與上述研究并不一致，考慮有兩方面原因。首先，BALF檢測例數(shù)不一致；其次，對BALF mNGS結(jié)果判讀不一致，相關(guān)研究對BALF mNGS的結(jié)果判讀綜合臨床表現(xiàn)和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，而 本研究客觀呈現(xiàn)mNGS的檢測結(jié)果，未摻入主觀判 斷。

本研究經(jīng)BALF mNGS檢測發(fā)現(xiàn)，在重癥MPP患兒中，合并11例腺病毒7型感染患兒；而常規(guī)病原檢測僅檢出1例腺病毒抗原（弱陽性）。提示BALF mNGS在合并病毒感染檢測方面存有優(yōu)勢。病毒培養(yǎng)困難，常規(guī)抗原檢測陽性率低，更不能進行具體分型。mNGS可以檢出腺病毒的具體基因分型，從而提供更好的臨床指導和預后判斷。HAdV-7 B型是 2019年我國南方發(fā)病地區(qū)主要流行株，多引起重癥肺炎，導致閉塞性細支氣管炎等多種后遺癥[18]。另外，mNGS檢測出的病毒讀數(shù)可以為評估病毒載量提供依據(jù)。

本研究也存在局限性。首先，病例數(shù)有限，本研究僅對47例BALF進行了mNGS的檢測；其次，未對臨床指標進行標準化，未結(jié)合臨床對mNGS檢測到的微生物進行篩選，在判定混合感染的客觀性和準確性上可能存在一些不足。

綜上，在兒童重癥MPP中，BALF mNGS相比傳統(tǒng)方法有更高的混合感染檢出率，尤其是對合并病毒感染的檢測更具優(yōu)勢，能早期進行病毒分型和病毒載量分析，為臨床提供診斷、治療和預后判斷依據(jù)。通過BALF mNGS的檢測，發(fā)現(xiàn)兒童重癥MPP合并人腺病毒7型感染的比例較高，而腺病毒7型是引起重癥肺炎和后遺癥的重要病毒類型，該發(fā)現(xiàn)為進一步闡明重癥MPP的發(fā)病機制和預后判斷提供了依據(jù)。