謝曉虹 王崇杰 張光莉 駱學(xué)勤 羅征秀 劉恩梅 羅 健

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸中心 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地 兒科學(xué)重慶市重點實驗室（重慶 400014）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童社區(qū)獲得性肺炎的常見呼吸道病原體，肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）通常具有自限性，阿奇霉素治療有效且預(yù)后良好。近年來兒童重癥MPP發(fā)病率增高，對于阿奇霉素治療不敏感的難治性MPP病例增多。這部分患兒急性期治療棘手，后期可能出現(xiàn)支氣管擴張、閉塞性細支氣管炎等后遺癥，因此尋找早期識別重癥MPP和難治性MPP的生物學(xué)標(biāo)志物是目前的研究熱點。外周血乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）可作為評估MPP病情和預(yù)判是否難治的重要指標(biāo)[1-2]，但不能反映肺部感染灶的真實炎癥狀態(tài)。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）來自于病變部位，BALF中細胞因子表達情況和細胞學(xué)分類能直接反映局部炎癥情況。已有研究發(fā)現(xiàn)，重癥和輕癥MPP患兒BALF前炎癥細胞因子表達量有顯著差異，且對病情有一定預(yù)測作用[3-4]。但MPP炎癥應(yīng)答是機體和MP共同作用的結(jié)果，鏡檢時的病程、肺內(nèi)病變類型和MP載量均可能引起B(yǎng)ALF細胞因子水平的差異。本研究回顧總結(jié)122例MPP患兒BALF細胞因子特點，及外周血生化指標(biāo)（D-二聚體、LDH和白蛋白）與BALF各細胞因子相關(guān)性，并分析發(fā)熱癥狀、鏡檢時是否持續(xù)發(fā)熱、MP載量、肺內(nèi)病變類型和阿奇霉素治療對BALF細胞因子檢測的影響，為臨床評判和治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象和分組

研究對象為2019年7月至2020年1月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸中心確診的MPP患兒。入選標(biāo)準：符合MPP診斷標(biāo)準且年齡＜18歲[5]，重癥MPP符合國內(nèi)兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎（CAP）診斷標(biāo)準[6]。排除標(biāo)準：①鼻咽抽吸物（nasopharyngeal aspiration，NPA）和BALF檢出除MP以外的其他病原體；②有原發(fā)性免疫缺陷、先天性心臟病和支氣管哮喘等基礎(chǔ)疾病者。

研究對象根據(jù)病情分為重癥組和普通組；根據(jù)臨床癥狀是否有發(fā)熱分為有熱組和無熱組；根據(jù)支氣管鏡檢時間與發(fā)熱的關(guān)系分為持續(xù)發(fā)熱鏡檢組（起病至支氣管鏡檢期間每天至少發(fā)熱1次）和熱退鏡檢組（起病時有發(fā)熱，但支氣管鏡檢時體溫正常至少24小時）；根據(jù)BALF標(biāo)本MP拷貝數(shù)分為高拷貝組（≥106copies/mL）和低拷貝數(shù)組（＜106copies/mL）；根據(jù)患兒胸部CT影像特點分為實變組（影像報告為單個或多個肺葉大片狀致密影）和斑片影組（影像報告為沿支氣管血管束分布的斑片致密影，無大片狀致密影）；根據(jù)阿奇霉素起效時間分為單一阿奇霉素有效組（阿奇霉素起效時間≤7天，阿奇霉素起效時間為單一阿奇霉素治療后體溫正常時的用藥天數(shù)）與單一阿奇霉素?zé)o效組（阿奇霉素治療7天仍有發(fā)熱）；根據(jù)出院后4周胸部影像學(xué)吸收情況分為完全吸收組（影像學(xué)報告為肺內(nèi)病變基本吸收或較前次明顯吸收）和部分吸收組（影像學(xué)報告為肺內(nèi)病變較前次略吸收或改變不明顯）。

1.2 方法

1.2.1 一般臨床資料收集 回顧性收集研究對象一般資料、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、支氣管鏡檢查結(jié)果、胸部影像結(jié)果和住院用藥情況等數(shù)據(jù)。實驗室檢查數(shù)據(jù)包括C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、D-二聚體、LDH；NPA和BALF病原學(xué)檢測（直接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A和B型、副流感病毒1～3型，培養(yǎng)法檢測細菌，聚合酶鏈反應(yīng)法檢測MP、肺炎衣原體、腺病毒和結(jié)核分支桿菌）；BALF行細胞學(xué)分類，BALF用流式細胞因子微球檢測法（cytometric beard assay，CBA）檢測細胞因子，包括白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α），干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-17A；BALF樣本用熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)法檢測肺炎支原體耐大環(huán)內(nèi)酯類基因A2063G和A2064G表達。實驗室和支氣管鏡檢查數(shù)據(jù)均為入院后首次檢查結(jié)果。住院用藥情況為口服和/或靜脈輸注阿奇霉素時間。胸部影像學(xué)包括住院期間胸部CT、出院后胸部CT或胸部X片結(jié)果，均由相應(yīng)資質(zhì)的放射科醫(yī)師審核報告。首次隨訪時間為出院后2周。

1.2.2 BALF收集方法 采用Olympus BF-P260F（外徑4.0 mm）或Olympus BF-XP260F （外徑2.8mm）支氣管鏡經(jīng)鼻咽部、會厭、聲門、氣管到達各段支氣管，根據(jù)胸部CT病變選擇灌洗部位。每位患兒給予37 ℃生理鹽水0.5～1 mL/kg，不超過20 mL/次進行灌洗。按照歐洲呼吸病學(xué)會推薦[7]，收集第1管灌洗液送病原學(xué)檢測，第2和第3管灌洗液合并送細胞學(xué)和細胞因子檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2或校正χ2檢驗。兩變量間相關(guān)性檢驗采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意 義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共收集MPP患兒122例，男62例、女60例，男女比例1.03:1；中位年齡4歲（范圍1～14歲），＜3歲29例、～6歲46例、≥6歲47例；支氣管鏡檢灌洗平均時間為發(fā)病后（11.5±0.4）天。重癥MPP患兒37例，包括持續(xù)無創(chuàng)正壓通氣32例，機械通氣1例，胸腔積液行胸腔穿刺檢查6例。

發(fā)熱患兒97例，其中重癥占33.0%，平均鏡檢灌洗時間為發(fā)病后（10.5±0.3）天；無熱患兒25例，重癥占20.0%，平均鏡檢灌洗時間為發(fā)病后（15.3±1.2）天；兩者灌洗時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.61，P＜0.001）。發(fā)熱患兒分為持續(xù)發(fā)熱組25例，重癥占44.0%；熱退組72例，重癥占29.2%，其中熱退1～3天行鏡檢灌洗50例，熱退3～5天行鏡檢灌洗22例。持續(xù)發(fā)熱組平均鏡檢灌洗時間為發(fā)病后（10.3±0.4）天，熱退組平均鏡檢灌洗時間為發(fā)病后（10.6±0.3）天，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.41，P=0.683）。

NPA或BALF標(biāo)本檢測MP高拷貝數(shù)患兒86例，29例重癥（33.7%）。64例MPP患兒行肺炎支原體耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物基因檢測，44例陽性（68.8%），重癥MPP耐藥基因陽性率為60.0%（18/30），普通MPP耐藥基因陽性率76.5%（26/34）。胸部影像學(xué)以肺葉實變影為主要特點的MPP患兒51例（41.8%），15例重癥（29.4%）；以斑片影為主要特點的MPP患兒71例（58.2%），22例重癥（31.0%）。97例發(fā)熱MPP患兒中有7例未用阿奇霉素治療發(fā)熱自行緩解，單一阿奇霉素治療7天仍發(fā)熱14例（15.6%），其中重癥MPP占71.4%（10/14）。72例MPP患兒出院后4周內(nèi)至少完成1次胸部影像學(xué)隨訪，25例為重癥MPP（34.7%），58例病變完全吸收（80.6%）。

2.2 不同分組MPP患兒BALF細胞因子、細胞學(xué)和生化指標(biāo)比較

122例MPP患兒BALF中細胞因子I L-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-17 A、IL-2和IL-4表達水平依次為159.7（51.3～386.2）pg/mL、8.5（2.5～25.8）pg/mL、5.0（2.5～14.3）pg/mL、4.8（2.5～23.7）pg/mL、4.6（2.5～16.9）pg/mL、2.5（2.5～2.5）pg/mL和2.5（2.5～2.5）pg/mL；BALF細胞總數(shù)（3 673.1±377.9）×106/L，巨噬細胞比例（23.6±17.6）%，淋巴細胞（22.1±16.2）%，中性粒細胞（46.5±24.8）%。

BALF細胞因子IL-6、TNF-α、IL-10和IFN-γ水平在有熱組和無熱組、持續(xù)發(fā)熱和熱退鏡檢組、阿奇霉素有效和無效組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。重癥MPP組IL-6、TNF-α、IFN-γ 和IL-17 A水平較普通MPP組明顯增高，高拷貝數(shù)組TNF-α、IL-10和IFN-γ水平較低拷貝數(shù)組明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。BALF細胞總數(shù)、吞噬細胞和中性粒細胞比例在有熱組和無熱組、高拷貝數(shù)組和低拷貝數(shù)組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。外周血D-二聚體在重癥和普通組、有熱和無熱組、持續(xù)發(fā)熱和熱退鏡檢組、高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)組、阿奇霉素?zé)o效和有效組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LDH在重癥和普通組、有熱和無熱組、持續(xù)發(fā)熱和熱退鏡檢組、高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)組、阿奇霉素?zé)o效和有效組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。外周血白蛋白在有熱和無熱組、持續(xù)發(fā)熱和熱退鏡檢組、高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)組、阿奇霉素?zé)o效和有效組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1～5。

實變組（51例）IL-6為252.8（73.6～561.7）pg/mL，斑片影組（71例）為120.7（32.5～317.1）pg/ mL；實變組TNF-α為16.6（3.0～47.3）pg/ mL，斑片影組為5.7 （2.5～19.1）pg/mL，兩組間IL-6和TNF-α水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.64、2.39，P均＜0.05）。實變組D-二聚體為0.9（0.5～2.0）pg/mL，斑片影組為0.5（0.4～0.9）mg/L；部分吸收組（14例）D-二聚體為1.9（0.8～3.4）mg/L，完全吸收組（58例）為0.6（0.5～1.1）mg/L，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.63、2.94，P均＜0.05）。實變組血白蛋白為（40.8±1.0）g/L，斑片影組為（43.4±0.5）g/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.42，P=0.016）。

表1 重癥和輕癥MPP組BALF細胞因子、細胞學(xué)和血生化指標(biāo)比較

表2 有熱和無熱組BALF細胞因子、細胞學(xué)和血生化指標(biāo)比較

表3 不同發(fā)熱時間MPP患兒BALF細胞因子、細胞學(xué)和血生化指標(biāo)比較

表4 不同MP拷貝數(shù)MPP患兒BALF細胞因子、細胞學(xué)和血生化指標(biāo)比較

表5 不同阿奇霉素治療應(yīng)答患兒BALF細胞因子、細胞學(xué)和血生化指標(biāo)比較

單一阿奇霉素?zé)o效組重癥MPP比例（10/14對19/76，χ2=9.64）和熱程＞10天比例（11/14對14/76，χ2=18.43）均明顯高于單一阿奇霉素有效組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 BALF各細胞因子之間及血生化指標(biāo)與BALF各細胞因子相關(guān)性分析

122例MPP患兒BALF細胞因子I L-6與IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17 A呈顯著正相關(guān)（r=0.384～0.719，P均＜0.001）。外周血D-二聚體與BALF細胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α 呈顯著正相關(guān)（r=0.323～0.452，P均＜0.001）。外周血LDH與BALF細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ 呈正相關(guān)（r=0.229～0.347，P均＜0.01）。外周血白蛋白與BALF細胞因子IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ呈負相關(guān)（r=-0.260～-0.214，P均＜0.05）。實變組D-二聚體與TNF-α呈正相關(guān)（r=0.542，P＜0.001）。單一阿奇霉素?zé)o效組LDH與IL-6、IFN-γ 呈正相關(guān)（r=0.732、0.587，P均＜0.05）。

3 討論

BALF細胞因子檢測對了解MPP局部炎癥應(yīng)答特點和評估病情有重要作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MPP患兒BALF中13種細胞因子明顯增高，前四位分別是單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1 β）、IL-6和TNF-α，再加上IL-10、IFN-γ 和IL-4共7種細胞因子，在重癥MPP組表達量顯著高于輕癥MPP組[3]。本研究顯示，MPP患兒BALF中細胞因子增高前四位分別是IL-6、TNF-α、IL-10和IFN-γ，重癥組和普通組的細胞因子表達差異與上述文獻報道相符。另有研究發(fā)現(xiàn)MPP急性期淋巴細胞比例較恢復(fù)期明顯下降，且輕重癥之間無差異[8]。本研究中MPP患兒IL-2和IL-4表達不僅基數(shù)小且整體變化幅度不大，說明淋巴細胞來源的IL-2和IL-4對MPP急性期炎癥反應(yīng)影響不大。

除了病情嚴重度，臨床是否有發(fā)熱癥狀、熱程、呼吸道標(biāo)本MP載量、胸部影像學(xué)病變和阿奇霉素治療效果不同，MPP患兒BALF細胞因子水平表達也有所不同，并伴隨外周血D-二聚體、LDH和白蛋白水平出現(xiàn)差異。本研究發(fā)現(xiàn)，有發(fā)熱癥狀、熱程超過10天、MP高載量、胸部影像學(xué)提示實變和單一阿奇霉素治療無效的患兒BALF中IL-6、TNF-α、IL-10和IFN-γ 有不同程度增高，外周血D-二聚體表達均增高，部分亞組LDH增高和白蛋白水平降低。IL-6和TNF-α 屬于內(nèi)源性致熱源，可導(dǎo)致MPP患者出現(xiàn)發(fā)熱，而無發(fā)熱患兒急性期行BALF細胞因子檢測臨床意義不大。有發(fā)熱癥狀的患兒平均鏡檢灌洗時間在病程10天左右，因此持續(xù)發(fā)熱鏡檢的實質(zhì)是熱程超過10天，熱程長可能提示局部炎癥因子增高持續(xù)存在。MP高拷貝數(shù)患兒BALF細胞因子和細胞學(xué)與低拷貝數(shù)組相比均存在顯著性差異，提示高載量MP患兒細胞因子增高可能與MP免疫病理損傷作用有關(guān)。胸部CT實變影和斑片影提示MP是直接損傷肺泡還是沿支氣管樹蔓延至肺泡，實變組增高的細胞因子僅有IL-6和TNF-α，說明兩者可能主要來源于肺泡上皮細胞或者巨噬細胞。上述亞組各分組之間重癥病例比例無顯著差異，說明各因素對BALF細胞因子的影響可能與病情嚴重度無關(guān)，意味著有發(fā)熱癥狀、呼吸道標(biāo)本檢出高載量MP或者出現(xiàn)肺實變的MPP患兒，即使是輕癥，BALF都可能出現(xiàn)各類細胞因子顯著增高的現(xiàn)象。本研究中單一阿奇霉素治療無效患兒，合并重癥和熱程超過10天患兒比例顯著增高，與其本質(zhì)為難治性支原體肺炎（refractoryMycoplasma pneumoniaepneumonia，RMPP）相一致。該組中IL-6和TNF-α 不僅基礎(chǔ)水平最高，且與治療有效組之間相差接近10倍，說明這部分患兒病變肺組織炎癥應(yīng)答最強烈。

MPP病變部位炎癥是MP與機體氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞和肺泡巨噬細胞相互作用的結(jié)果，募集至局部的中性粒細胞和淋巴細胞同樣參與炎癥應(yīng)答過程。體外人氣道上皮細胞和A 549細胞株實驗數(shù)據(jù)顯示，MP感染或者MP來源的丙酮酸生成酶可刺激細胞釋放IL-6和TNF-α[9-10]。MP社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征（community-acquired respiratory distress syndrome，CARDS）毒素刺激RAW 267.4巨噬細胞株可產(chǎn)生TNF-α[11]。MP或MP相關(guān)抗原刺激小鼠模型后的研究數(shù)據(jù)提示IL-10、IFN-γ 和IL-17 A可能來源于淋巴細胞[12-13]。本研究MPP患兒BALF中上皮細胞來源的IL-6與上皮細胞和巨噬細胞來源的TNF-α，淋巴細胞來源的IL-10、IFN-γ 和IL-17呈高度正相關(guān)，表明MPP患兒局部炎癥反應(yīng)是機體天然免疫應(yīng)答調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答的過程。血清D-二聚體、LDH與灌洗液各細胞因子呈正相關(guān)，白蛋白水平與各細胞因子呈負相關(guān)，表明上述生化指標(biāo)變化在一定程度上能夠反映局部病變炎癥應(yīng)答的強弱，便于基層醫(yī)師在疾病早期評判MPP患兒肺部炎癥情況。而在無熱組上述相關(guān)性則消失，提示評估對象具有選擇性。肺實變組血清D-二聚體與灌洗液TNF-α表達量明顯高于斑片影組，且呈正相關(guān)關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，血清D-二聚體水平高的肺炎患者胸部影像學(xué)病變更廣泛[14]，且MPP患兒外周血TNF-α水平比健康人群明顯增高[15]，因此血清D-二聚體與肺內(nèi)病變范圍的關(guān)系可能通過血清D-二聚體與血清TNF-α水平的內(nèi)在聯(lián)系來解釋。少數(shù)重癥MPP患兒肺大片實變同時伴D-二聚體＞500 μg/L，此時還應(yīng)考慮實變病因是否為肺栓塞，血清D-二聚體聯(lián)合TNF-α可能有助于了解抗凝治療效果[16]。單一阿奇霉素治療無效組中血清LDH與BALF中IL-6水平呈顯著正相關(guān)，表明RMPP患兒肺泡上皮細胞和/或肺泡巨噬細胞持續(xù)損傷破壞，不僅釋放IL-6還可能是LDH的來源之一，可同步行BALF和外周血LDH同工酶檢測來明確。其次研究發(fā)現(xiàn)LDH同工酶預(yù)測RMPP的敏感性更高[17]，因此動態(tài)監(jiān)測血清LDH同工酶水平可能具有間接反映RMPP患兒肺部炎癥變化的價值。

總之，MPP患兒局部炎癥應(yīng)答以IL-6和TNF-α為代表的前炎癥細胞因子增高為主。重癥MPP，或MPP患兒有發(fā)熱癥狀、支氣管鏡檢時已發(fā)熱10天以上、MP高載量感染、胸部影像以肺實變?yōu)橹骱蛦我话⑵婷顾刂委煙o效時，BALF細胞因子水平均明顯增高。因此病情嚴重度不是影響B(tài)ALF細胞因子水平的唯一因素，需要嚴格把握和評估MPP患兒行BALF細胞因子檢測的指征。MPP患兒外周血D-二聚體、LDH和白蛋白水平與BALF各細胞因子之間存在一定的相關(guān)性，在沒有支氣管鏡檢條件時，可結(jié)合臨床表現(xiàn)和外周血生化指標(biāo)推測MPP肺部炎癥情況。血清D-二聚體與灌洗液TNF-α，血清LDH與灌洗液IL-6分別在肺實變組和單一阿奇霉素治療無效組明顯增高，并呈顯著正相關(guān)，這可為進一步研究MPP肺內(nèi)病變性質(zhì)及預(yù)后和RMPP肺部炎癥變化提供線索。