邱 欣 王 偉 吳秋紅 薛子成 李 雨 劉衛(wèi)東

山東省棗莊市婦幼保健院藥學(xué)部 277000

目前通過(guò)相關(guān)生殖助孕技術(shù)出生的新生兒占2%～3%[1-2]。在輔助生殖技術(shù)中，目前使用最多的是體外受精—胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)技術(shù)。該技術(shù)治療過(guò)程的第一步即為控制性超促排卵(Controlled ovarian hyperstimulation，COH)。卵巢對(duì)外源性促性腺激素的反應(yīng)能力是IVF-ET成功的關(guān)鍵影響要素之一[3]。但不孕癥患者對(duì)外源性促性腺激素的反應(yīng)存在個(gè)體差異性，同時(shí)引起卵巢反應(yīng)性差異的真正機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為主要與患者年齡、卵巢儲(chǔ)備、卵巢局部的旁/自分泌活動(dòng)及遺傳等因素相關(guān)。

雌激素(Estrogen，E)是一種通過(guò)與雌激素受體(Estrogen receptor，ER)結(jié)合而發(fā)揮作用的類固醇類激素[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)ER有兩種亞型，即ERα和ERβ，分別由ER1和ER2基因編碼。由于其存在遺傳多態(tài)性，可能影響ERα和 ERβ的表達(dá)和相關(guān)功能，其次不同個(gè)體間COH的臨床結(jié)局也有很大差異，這將導(dǎo)致卵巢反應(yīng)過(guò)低或嚴(yán)重的卵巢過(guò)度刺激征的發(fā)生[5-6]。因此，本文初步探討了雌激素受體基因多態(tài)性與魯南地區(qū)漢族婦女卵巢反應(yīng)性的相關(guān)性，以期為不孕癥患者的臨床個(gè)體化給藥提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 入選研究對(duì)象為2018年1月—2019年12月在棗莊市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF-ET技術(shù)或卵母細(xì)胞顯微單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI) 的100例不孕患者。本研究經(jīng)山東省棗莊市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 年齡20～40歲；(2) BMI：18～30； (3) 月經(jīng)周期正常；(4) 基礎(chǔ)卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)值在5～12IU/L之間；(5) 因女方輸卵管因素或男方因素行IVF治療；(6) 第一次接受COH治療； (7) 染色體核型正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵巢或相鄰臟器手術(shù)史者；(2)其他婦科、內(nèi)分泌及代謝異常疾病者；(3)異?；A(chǔ)竇卵泡數(shù)；(4)其他臨床醫(yī)師或研究人員認(rèn)為不適合納入的對(duì)象。

1.2 控制性超促排卵方案與取卵 所有患者均使用促性腺激素釋放激素拮抗劑(Gonadotropin releasing hormone antagonist，GnRH-A)。于月經(jīng)第3天根據(jù)基礎(chǔ)患者FSH、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(Antral follicle count，AFC)與BMI等指標(biāo)采用重組卵泡刺激素75～200IU啟動(dòng)促排卵。當(dāng)主卵泡群卵泡直徑>12mm時(shí)，給予GnRH拮抗劑。當(dāng)主導(dǎo)卵泡群中至少2個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑>18mm，并參考患者雌激素水平，在合適時(shí)單次注射人絨毛促性腺激素500～10 000單位誘導(dǎo)排卵，并于36h后行經(jīng)陰超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)。

1.3 儀器與試劑 熒光檢測(cè)儀(TL 998A，西安天隆科技有限公司)；渦旋混合儀(XW-3，上海滬西分析儀器廠有限公司)；低溫離心機(jī)(Centrifuge 5430R，德國(guó)eppendorf)；熒光染色原位雜交及染色體核型分析系統(tǒng)(北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司)。

GnRH拮抗劑(GnRH-A，ORGALUTRAN：N．V．Organon)；人絨毛促性腺激素(中國(guó)麗珠制藥)；氯化銨溶液、核酸純化試劑(北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：20190211)，測(cè)序反應(yīng)試劑盒(北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：20190815)。

1.4 方法

1.4.1 樣本收集和分組:所有入組患者取外周靜脈血2～3ml置于EDTA抗凝管中。根據(jù)COH 的情況將患者分為三組：(1)卵巢高反應(yīng)組(高反應(yīng)組)：獲卵數(shù)≥15個(gè)。(2)卵巢低反應(yīng)組(低反應(yīng)組)：當(dāng)COH 過(guò)程中出現(xiàn)以下情況之一即納入本組：獲卵數(shù)≤5個(gè)，HCG 注射日E2<500ng/L，平均每日Gn劑量≥300IU，總Gn用量≥44支(75IU/支)，Gn刺激時(shí)間≥15d。(3)正常反應(yīng)組(正常組)：獲卵數(shù)6～14個(gè)，此組作為對(duì)照組。

1.4.2 樣本前處理:精密量取滅菌注射用水900μl至1.5ml離心管中，加入100μl預(yù)處理液和200μl全血樣本，渦旋混合后置10min離心(轉(zhuǎn)速3 500r/min，5min)，棄上清液。在富集的白細(xì)胞沉淀中加入核酸純化試劑 50μl，反復(fù)吹打混勻后室溫靜置 20～40min，得到白細(xì)胞混懸液。精密吸取白細(xì)胞混懸液2.0μl加入至測(cè)序反應(yīng)試劑中充分混勻，采用熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，采用染色體核型分析系統(tǒng)直接讀取基因分型結(jié)果。

1.4.3 基因型測(cè)定:按“1.4.2”項(xiàng)下方法提取100例不孕癥患者的白細(xì)胞混懸液，吸取2.0μl分別加入至ER基因位點(diǎn)測(cè)序反應(yīng)試劑中，充分混勻，采用熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并使用染色體核型分析系統(tǒng)直接讀取基因分型結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 一般資料和Hardy-Weinberg平衡 本試驗(yàn)共納入100例不孕患者，其一般資料(年齡、體質(zhì)量、BMI和FSH值)見(jiàn)表1。

表1 三組患者的基本資料比較

2.2 ERα基因型和等位基因頻率比較 高反應(yīng)組和低反應(yīng)組患者ERα基因位點(diǎn)PvuⅡ (rs2234693)基因型頻率與等位基因頻率與正常組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。高反應(yīng)組患者ERα基因位點(diǎn)Xba Ⅰ(rs9340799)等位基因頻率與正常組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然而，低反應(yīng)組患者ERα基因位點(diǎn)XbaⅠ(rs9340799)等位基因頻率與正常組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 ERα基因型及等位基因分布頻率[n(%)]

2.3 ERβ基因型和等位基因頻率比較 高反應(yīng)組和低反應(yīng)組患者ERβ基因位點(diǎn)RsaⅠ(rs1256049)基因型頻率和等位基因頻率與正常組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。高反應(yīng)組和低反應(yīng)組患者ERβ基因位點(diǎn)AluⅠ(rs4986938)基因型頻率和等位基因頻率與正常組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 ERβ基因型及等位基因分布頻率[n(%)]

3 討論

隨著人民生活水平的日益提高，不孕癥的發(fā)生率也隨之逐漸增高，因此越來(lái)越多的患者接受輔助生殖助孕技術(shù)進(jìn)行治療[7]。隨著接受COH治療患者的增加，卵巢過(guò)度刺激綜合征(Ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的發(fā)生率逐年增加。

相關(guān)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)ER基因在卵巢反應(yīng)中起著重要作用[8-11]，ER基因突變與COH結(jié)局密切相關(guān)[4,12]。許多婦科及內(nèi)分泌疾病如不孕癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌以及子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生都可能與ER基因多態(tài)性相關(guān)[13]。ER有ERα和ERβ兩個(gè)亞型，分別由ER1和ER2基因編碼。ER基因具有高度的基因多態(tài)性，目前已發(fā)現(xiàn)ER1基因有2 800多個(gè)SNP位點(diǎn)，ER2基因有720多個(gè)SNP位點(diǎn)。其中位于ERl基因內(nèi)含子l上的PvuⅡ T/C(rs2234693)、XbaⅠ A/G(rs9340799)，位于ER2基因的AluⅠ G/A(rs4986938)位點(diǎn)與COH治療反應(yīng)性的相關(guān)性已被國(guó)內(nèi)外大量研究者進(jìn)行了探索。Sundarrajan等[12]發(fā)現(xiàn)使用IVF治療的200例新加坡華裔不孕患者與正常人群相比，卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)和妊娠率在PvuⅡ CC、TC、TT基因型3組間均存在顯著性差異。Georgiou等[4]發(fā)現(xiàn)，希臘人群中的ER1基因PvuⅡ T/C位點(diǎn)與COH或IVF患者的妊娠結(jié)局顯著相關(guān)。Altmae等[5]研究也發(fā)現(xiàn)，ERl基因PvuⅡ T/C的CC和XbaⅠ A/G的GG基因型對(duì)COH治療有較好的反應(yīng)，并增加IVF的成功率。

而本研究結(jié)果顯示：低反應(yīng)組患者ERα基因位點(diǎn)XbaⅠ(rs9340799)等位基因頻率與正常組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此，ERα基因位點(diǎn)XbaⅠ(rs9340799)基因多態(tài)性與魯南地區(qū)漢族婦女COH中的卵巢低反應(yīng)相關(guān)，G等位基因可增加卵巢低反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

ER基因在不同地域和種族間的分布存在的差異性也導(dǎo)致了研究結(jié)論的不一致[4,12-14]。因此，ER基因多態(tài)性與不孕癥婦女卵巢反應(yīng)性的相關(guān)性研究仍需要擴(kuò)大樣本量，并在不同地域和種族間進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探討。

隨著人類從基因水平對(duì)許多疾病進(jìn)行深入的探究，基因組學(xué)研究正在不斷發(fā)展進(jìn)步，可能在不久的將來(lái)會(huì)有更多疾病的易感性被證實(shí)與其相關(guān)基因多態(tài)性有關(guān)，并進(jìn)行了多地區(qū)、多種族和大樣本的系統(tǒng)研究，從而疾病的預(yù)防和治療也將進(jìn)入新的領(lǐng)域。