李欣宇，孫雨露，徐巖，張榮珍*，唐柯*

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫， 214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫， 214122)

黑果腺肋花楸 (Aroniamelanocarpa(Michx.) Elliott)，俗稱黑櫻莓，薔薇科 (Rosaceae) 腺肋花楸屬 (Aronia)，原產于北美[1]，20世紀90年代引入中國種植。其果實中含有豐富的多酚和花青素[2]，其中的多酚具有良好的抗氧化作用，對肥胖癥、糖尿病和心血管疾病(如高血脂、高血壓等)等具有有益作用[3-4]。

本研究主要通過對黑果腺肋花楸酒在不同容器陳釀過程中總酚、總花色苷、單體酚以及3種不同抗氧化指標(ABTS、DPPH、FRAP)的變化進行測定，分析不同陳釀容器和陳釀時間對黑果腺肋花楸果酒抗氧化性的影響。本研究不僅為黑果腺肋花楸酒陳釀過程中抗氧化變化及潛在的有益健康作用提供參考，同時對酒的陳釀方式提供了選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸(A.melanocarpa(Michx.) Elliott)果實(產自長白山)；3 L中國橡木桶(蒙古櫟(Q.mongolica),中度烘烤，東佳兄弟橡木桶有限公司)；3 L法國橡木桶(法國無柄橡(Quercuspetraea)，中度烘烤，法國維卡項目公司)；3 L不銹鋼罐，曲阜市恒通酒容器有限公司；D254酵母，法國Lallemand公司；果膠酶EX-V，法國Laffort公司；白砂糖(市售)；福林酚(Folin-Phenol)試劑,美國Sigma-Aldrich公司；綠原酸、原兒茶酸、咖啡酸、沒食子酸、表兒茶素、p-香豆酸、鞣花酸、蘆丁(色譜級，純度>95%)，美國Sigma-Aldrich公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(Sigma-Aldrich公司)；96孔板(麥斯諾有限公司)；甲醇(色譜純，上海安譜科學儀器公司)；氯化鉀醋酸鈉葡萄糖、鹽酸、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉等試劑(國藥集團化學試劑有限公司)；總抗氧化能力(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)測定試劑盒、鐵還原抗氧化能力(ferric reducing/antioxidant power,FRAP)試劑盒(上海哈靈生物有限公司)。

1.1.2 主要儀器與設備

超聲波清洗器,寧波新芝生物科技股份有限公司；FE20實驗室pH計,梅特勒-托利多儀器有限公司；Avanti J-E高速離心機,BeckMAN公司；旋轉蒸發(fā)儀,瑞士BUCHI公司；DK-S24型恒溫水浴鍋,上海森信實驗儀器有限公司；酶標儀,美國Thermoscientific公司；FA1004天平,HANGPING公司；WFZ UV-2802H型紫外可見分光光度計,尤尼柯儀器有限公司；Milli-Q純水儀,美國Millipore公司；ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果酒的發(fā)酵及陳釀工藝

黑果腺肋花楸果實破碎后，按照質量比2∶1加水稀釋，加入60 mg/L SO2, 12 h后添加0.2%的果膠酶，放置3 h，添加蔗糖將含糖量調整為226.4 g/L，按照2%的比例接入活化好的酵母，27 ℃控溫發(fā)酵。發(fā)酵結束將皮渣分離，將SO2的質量濃度調整至80 mg/L獲得原酒。將原酒分別置于不銹鋼罐、中國橡木桶和法國橡木桶中，20 ℃恒溫避光陳釀，陳釀的第0、10、20、30、60、90、180、270天取樣，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基本理化指標的測定

總糖、總酸、酒精度按照國標GB/T15 038—2006測定，pH利用pH計測定。

色度和色調參照CHIRA等[14]的方法，先將酒樣稀釋10倍再利用分光光度計進行測定。

色度=A420+A520+A620

(1)

(2)

1.2.3 總酚的測定

采用福林酚法。用蒸餾水將酒樣稀釋50倍，取0.5 mL樣品于試管中，加入1 mL福林酚試劑、3 mL 10% Na2CO3溶液，混合均勻于37 ℃避光反應40 min，在760 nm的波長下測定吸光值。以沒食子酸作為標準品繪制標準曲線，總酚含量以沒食子酸當量表示(mg/L)。

1.2.4 總花色苷的測定

采用pH示差法。取0.1 mL酒樣于試管中，分別加入pH=1.0(KCl-HCl)緩沖液和pH=4.5(CH3COONa)的緩沖溶液，定容至5 mL，搖勻，避光穩(wěn)定15～20 min，分別于520和700 nm下測定吸光值，在30 min之內完成測定。總花色苷按公式(2)計算：

ΔA=(A250-A700)pH 1.0-(A520-A700)pH 4.5

(3)

(4)

式中：ω,樣品中花色苷質量濃度，mg/L；n,稀釋倍數(shù)；MW,矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-Glu)的相對分子質量，449.2；ε,矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；l,液層的厚度，cm。

1.2.5 單體酚的測定

采用ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱，流速0.3 mL/min，進樣量1 μL，以外標法定量。洗脫程序參照課題組前期已建立的方法[15]。酒樣用0.45 μm的有機相濾膜過濾后直接進樣。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測定

按照ABTS試劑盒標注方法進行測定。

1.2.7 FRAP還原鐵能力測定

按照FRAP試劑盒標注方法進行測定。

1.2.8 DPPH自由基清除能力測定

DPPH甲醇溶液：12.5 mg DPPH溶于甲醇，定容至100 mL后稀釋5倍得到2 mmol/L的DPPH-甲醇溶液。

參照唐柯等[16]的方法稍有修改。將0.1 mL酒樣添加到3.9 mL DPPH-甲醇溶液中，渦旋振蕩，在室溫下于黑暗中靜置30 min，在516 nm下測定吸光度，空白對照用10%的甲醇代替樣品，結果表示為DPPH(%)。DPPH自由基清除率按公式(5)計算：

(5)

式中：Ai，空白對照在516 nm下的吸光度，nm；Aj，酒樣在516 nm下的吸光度，nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)重復3次取平均值，用平均值±標準偏差(mean ± SD)表示，使用IBM SPSS Statistics 24軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并使用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 基本理化指標的變化

如表1所示，陳釀后3組酒樣的總糖、pH、總酸、色度和色調與原酒相比存在顯著差異，主要是在陳釀期間酒樣發(fā)生了一系列反應。橡木桶的酒樣總酸含量顯著高于原酒和不銹鋼組，同時pH降低，這是因為橡木桶陳釀過程中浸出物含有揮發(fā)酸類物質使酒樣總酸含量升高[17]。橡木桶內酒樣酒精度顯著降低的主要原因是：陳釀過程中少量酒精會通過橡木桶桶隙蒸發(fā)；陳釀過程中酒精與一些酸類物質結合生成了酯類物質。色度和色調是評價果酒顏色的重要指標，2個橡木桶組之間的差異不顯著，但色度比對照組和原酒組顯著降低；3組酒樣的色調都比原酒組顯著升高。

表1 黑果腺肋花楸酒基本理化指標的變化Table 1 Change of basic physical and chemical indexes of A.melanocarpa wine

(2)小寫字母不同表示同一列之間差異顯著，P<0.05

2.2 陳釀過程中活性物質的變化

2.2.1 陳釀過程中總酚的變化

不同陳釀容器的黑果腺肋花楸果酒陳釀過程中總酚含量變化如圖1所示，原酒總酚含量是2 916.74 mg/L。在陳釀期間3組樣品的總酚含量都逐漸降低，可能是因為在陳釀期間酚類物質發(fā)生了氧化反應或單寧類物質發(fā)生縮合反應產生沉淀[18]。但是在陳釀270 d 后，不銹鋼罐組總酚含量顯著高于2個橡木桶組，具體為不銹鋼罐組比初始降低了14.53%，中國橡木桶組降低了27.67%，法國橡木桶降低了25.89%。

圖1 黑果腺肋花楸果酒陳釀過程中總酚含量變化Fig.1 Change of total phenolic concentration in A.melanocarpa wine

2個橡木桶組酒樣在陳釀的前60 d總酚含量下降速度顯著大于不銹鋼罐組，可能是因為橡木桶提供了微氧的環(huán)境促進了黃烷醇和花色苷的縮合反應以及花色苷的氧化反應[19]。在陳釀的180～270 d橡木桶內總酚的濃度逐漸趨于穩(wěn)定，而不銹鋼罐組仍在持續(xù)下降。

2.2.2 陳釀過程中花色苷的變化

如圖2所示，在0～20 d三組酒樣的總花色苷質量濃度迅速降低，可能是由于新酒中含有大量的溶解氧，花色苷在氧氣充足的情況下發(fā)生了一系列反應[20]。在30～60 d兩個橡木桶組花色苷濃度下降速度緩慢，可能是因為橡木桶浸出物發(fā)生花色苷不參加的氧化反應消耗了部分溶解氧[21]

圖2 黑果腺肋花楸酒總花色苷濃度變化Fig.2 Change of total anthocyanins concentration in A.melanocarpa wine

新酒的總花色苷質量濃度是300 mg/L，陳釀270 d后，3組酒樣的花色苷質量濃度都大幅度降低，分別降低了58%、71%和74%。這是由于新鮮果酒中花色苷主要是以單體的形式存在，而在陳釀過程中，單體花色苷通過與其他化合物反應形成花色苷衍生物，包括吡喃花色苷、聚合花色苷等[22]。據(jù)報道，多數(shù)花色苷聚合反應都有其他酚類物質的參加[23]。而橡木桶內花色苷降低速度比不銹鋼罐組快可能是由于：酒樣中部分單體花色苷被橡木桶的木材吸附[24]；橡木桶提供了微氧環(huán)境加快了花色苷及其衍生物的沉淀；橡木桶浸出物在乙醛的作用下與花色苷進行了縮合反應[13]，產生了沉淀。

2.2.3 陳釀過程中單體酚的變化

單體酚檢測結果見表2。以不同方式陳釀，從樣品中共檢測出8種單體酚，其中包括6種酚酸(綠原酸、原兒茶酸、咖啡酸、沒食子酸、p-香豆酸、鞣花酸)，1種黃烷醇(表兒茶素)和1種黃酮醇(蘆丁)。

3組酒樣中的綠原酸、表兒茶素和蘆丁均隨著陳釀時間的延長濃度降低，在陳釀270 d，綠原酸在中國橡木桶的下降速度顯著高于法國橡木桶和不銹鋼罐；表兒茶素在橡木桶中下降的速度顯著高于不銹鋼罐，具體為在中國橡木桶中降低了54.70%、法國橡木桶中降低了85.47%、不銹鋼罐中降低了10.26%；蘆丁在橡木桶中下降的速度同樣顯著高于不銹鋼罐，具體為在中國橡木桶中降低了75.64%、法國橡木桶中降低了76.77%、不銹鋼罐中僅降低了63.27%。與之相反的是原兒茶酸、沒食子酸和鞣花酸均隨著陳釀時間的延長含量不斷上升，其中原兒茶酸和沒食子酸在橡木桶中上升的速度顯著低于不銹鋼罐。由于橡木桶內的鞣花酸主要是橡木桶浸漬的水解單寧水解生成的[25]，因此，不銹鋼罐組中并未檢測到鞣花酸。而其他兩種單體酚：咖啡酸在橡木桶中無明顯變化，在不銹鋼罐中升高了28.79%；p-香豆酸在中法2個橡木桶中分別升高了9.59%、9.75%,而不銹鋼罐中略降低。

2.3 陳釀過程中抗氧化能力的變化

2.3.1 ABTS總抗氧化能力

如圖3所示，3組酒樣的ABTS自由基清除能力在陳釀的過程中顯著下降。這與BEER等[26]在皮諾塔吉、赤霞珠、霞多麗和白詩南葡萄酒陳釀過程中抗氧化性持續(xù)降低的研究結論相似。不銹鋼罐組降低了17.16%，中國橡木桶組降低了30.83%，法國橡木桶組降低了24.78%。2組橡木桶酒樣的ABTS自由基清除能力明顯比對照組的下降速度快，在陳釀270 d 時3組樣品ABTS自由基清除能力大小排序：不銹鋼罐組>法國橡木桶組>中國橡木桶組，這一結果與陳釀過程中總酚濃度變化結果相似。

表2 黑果腺肋花楸酒中單體酚含量的變化 單位：mg/L

圖3 黑果腺肋花楸果酒的ABTS總抗氧化能力Fig.3 Change of ABTS antioxidant capacity in A.melanocarpa wine

2.3.2 DPPH自由基清除能力測定

如圖4所示，3組酒樣的DPPH自由基清除能力同樣在陳釀的過程中顯著下降：不銹鋼罐組降低了18.31%，中國橡木桶組降低了25.35%，法國橡木桶組降低了22.54%。在0～30 d兩組橡木桶DPPH自由基清除能力快速下降，而不銹鋼罐組下降速度稍微緩慢一些。30～60 d兩組橡木桶DPPH自由基清除能力升高可能與花色苷濃度升高有關[27]。

圖4 黑果腺肋花楸果酒的DPPH自由基清除能力Fig.4 Change of DPPH free radical scavenging rate in A.melanocarpa wine

2.3.3 FRAP還原鐵能力測定

如圖5所示，在陳釀的0～20 d三組酒樣的FRAP還原鐵能力快速降低：不銹鋼罐組降低了60.15%；中國橡木桶組降低了74.05%；法國橡木桶組降低了52.80%。這一規(guī)律與花色苷的變化相似。據(jù)TSAI等人[28]的研究，F(xiàn)RAP還原鐵能力與單體花青素含量密切相關。而3組樣品在20 d以后隨著陳釀時間的延長，F(xiàn)RAP還原鐵能力沒有太大的變化。

圖5 黑果腺肋花楸果酒FRAP還原鐵能力測定變化Fig.5 Change of FRAP ability in A.melanocarpa wine

2.4 相關性分析

表3為總酚、總花色苷與3種抗氧化能力的相關性分析結果，這5個指標呈兩兩正相關。其中總酚與ABTS和DPPH相關性極顯著，這與王婷婷等[29]在研究復合漿果酒的酚類物質和抗氧化性關系的結論一致；花色苷與ABTS、DPPH和FRAP的相關性極顯著，據(jù)SUN等人[30]的報道，吡喃花青素具有很強的DPPH自由基清除能力，并且吡喃環(huán)越多，DPPH自由基清除能力越強。

表3 總酚、總花色苷與三種抗氧化能力的相關性Table 3 Correlation between total phenol, total anthocyanin and three antioxidant capacity

3 結論

陳釀時間和陳釀容器對黑果腺肋花楸酒的3種抗氧化能力(ABTS、FRAP、DPPH)均有影響。隨著陳釀時間的延長，3組酒樣的抗氧化性都是降低的，而2個橡木桶組在陳釀過程中降低的速度比不銹鋼罐組快，這與總酚和總花色苷含量的變化趨勢相似，說明黑果腺肋花楸酒陳釀時間越長，總酚和總花色苷濃度越低，抗氧化能力越弱。由相關性分析可知，總酚、總花色苷、ABTS、FRAP、DPPH呈兩兩正相關，其中ABTS總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力與總酚和總花色苷的相關性極顯著(P<0.01)；FRAP還原鐵能力與花色苷相關性極顯著(P<0.01)。陳釀時間和陳釀容器對黑果腺肋花楸酒中的單體酚含量均有影響。其中，綠原酸、表兒茶素和蘆丁隨著陳釀時間的延長，含量不斷降低；鞣花酸、沒食子酸和原兒茶酸則隨著陳釀時間的延長，含量不斷上升；其他2種單體酚含量變化不大。此外，在不同陳釀容器中，單體酚的變化趨勢也略有不同。

本研究明確了不同陳釀容器和陳釀時間對黑果腺肋花楸酒抗氧化能力的影響，研究不僅為深入研究黑果腺肋花楸酒陳釀過程中抗氧化變化機理提供理論基礎，而且對黑果腺肋花楸酒陳釀過程中調控也具有良好的實踐意義。