徐文倩, 葉姜瑜，2*

(1．重慶大學 環(huán)境與生態(tài)學院，重慶 400045；2.重慶大學 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400045)

微生物與水產養(yǎng)殖對象密不可分，其相互作用貫穿水產養(yǎng)殖的全過程。近年來對養(yǎng)殖對象腸道菌群的研究，揭示了養(yǎng)殖環(huán)境微生物對宿主的健康具有不同程度的影響，探索了微生物制劑改善養(yǎng)殖水質及宿主的健康的方法。Zhu等[1]研究表明，在無交換水的凡納對蝦(Penaeusvannamei)養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加MarichromatiumgracileYL28，20 d后，YL28減少了銨的積累，顯著降低了99.3%的亞硝酸鹽。Wang等[2]研究發(fā)現，含4種復合益生菌的微生物制劑對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的生長以及對其健康狀況的改善作用優(yōu)于單一益生菌。因此，通過微生物調控可減少水產藥物的使用、提高飼料利用效率，對水資源匱乏、水環(huán)境污染嚴重的地域意義尤為重大。如何利用好有益微生物調控水質、抑制水產養(yǎng)殖對象體內外病原微生物已成為綠色生態(tài)養(yǎng)殖研究和發(fā)展的重點內容。紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)又稱四脊光殼螯蝦、澳洲淡水龍蝦，具有個體大、生長快、食性雜、適應性強、可純淡水繁殖等特點，有望在中國進行大規(guī)模養(yǎng)殖[3]。目前國內對紅螯螯蝦的研究主要集中在生殖生物學[4]、營養(yǎng)需求[5-6]、免疫力[7-9]等基礎研究，針對紅螯螯蝦高密度養(yǎng)殖系統(tǒng)中的微生物學研究還處于空白?，F階段紅螯螯蝦養(yǎng)殖仍以池塘養(yǎng)殖為主，疫病預防和水體水質調控是養(yǎng)殖過程中的重點任務。本研究采用周期性施加微生物制劑的方法，考察微生物制劑在短期內調控和穩(wěn)定高密度養(yǎng)殖系統(tǒng)條件下，紅螯螯蝦的養(yǎng)殖水質及其腸道菌群的變化情況，從而探究提高紅螯螯蝦存活率的方法，提出紅螯螯蝦高密度養(yǎng)殖、減少藥物使用的科學依據，達到綠色生態(tài)養(yǎng)殖的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蝦種及飼料 挑選372只質量為50 g左右，大小相近且健康的亞成蝦(購自廣東省佛山市某水產市場)。普通2號蝦料，成分見表1。

1.1.2 菌種 乳酸菌(Lactobacilluschiayiensis)、玉米乳酸菌(Lactobacilluszeae)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、不動桿菌(Acinetobacter)等4株功能菌均從河道底泥中篩選獲得。

1.1.3 培養(yǎng)基(g/L) ①MRS培養(yǎng)基：酪蛋白胨 10.0，牛肉浸取物 10.0，酵母提取物 5.0，葡萄糖 5.0，乙酸鈉 5.0，檸檬酸二胺 2.0，吐溫-80 1.0 mL，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·7H2O 0.05， pH 6.8；②LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.0，NaCl 10.0，酵母浸出粉 5.0，pH 7.0。以上培養(yǎng)基121 ℃、1×105Pa滅菌20 min。

表1 2號蝦料主要成分

1.1.4 主要試劑 納式試劑(環(huán)保標準，成都科龍化學品有限公司)，過硫酸鉀、抗壞血酸、酒石酸鉀鈉、鉬酸銨、酒石酸銻鉀、鹽酸、4-氨基苯磺酰氨、N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽、氨基磺酸、氫氧化鈉及培養(yǎng)基中使用的試劑為分析純，均購自重慶川東化工集團有限公司,DNA提取試劑盒FastDNA?SPIN Kit for Soil 購自美國MP Biomedicals公司。

1.1.5 主要儀器與設備 標準元素型超純水機(ATSelem 1810A，安特生)，千分之一天平(AL104-IC，梅特勒-托利多)，高壓蒸汽滅菌鍋(BXM-30R，博迅)，超凈工作臺臺(SW-CJ-1FD，蘇凈)，恒溫搖床(QYC-200，?，?，電熱恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9082MBE，博迅)，pH計(PHSJ-3F，上海雷磁)，臺式高速離心機(TG16-WS，湘儀)，紫外分光光度計(UV2600，日本島津)，分光光度計(Nano Drop 2000 UV-vis，賽默科技，美國)，PCR擴增儀(GeneAmp 9700，ABI，美國)。

1.2 方法

1.2.1 紅螯螯蝦的養(yǎng)殖 將蝦種隨機分成兩組：對照組IC和實驗組IT，每組3個重復，每個重復62只蝦。每個養(yǎng)蝦池為內循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，循環(huán)水體積為 150～160 L，溫度22～26 ℃，每個養(yǎng)蝦池尺寸為0.8 m×1.2 m，水位8～10 cm。蝦料日投食量為每組紅螯螯蝦總重量的4%，每日投喂2次，早9點喂日投食量的25%，晚7點喂日投食量的75%。

1.2.2 菌劑的制備與使用 自制復合菌劑M5包含4株功能菌，其中2株乳酸菌作為益生成分, 1株異養(yǎng)硝化菌主要用于水質保障，1株枯草芽胞桿菌兼具益生與凈化水質的作用。將4株菌株分別培養(yǎng)到穩(wěn)定期，其中乳酸菌L.chiayiensis(GenBank登記號MN508945)與玉米乳酸菌L.zeae(GenBank登記號MN508946)分別接種MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h，OD600控制在3.5左右，活菌量控制在(1～2)×1010cfu/mL；而不動桿菌AcinetobacterQETG_s(GenBank登記號MN508947)與枯草芽胞桿菌B.subtilis(GenBank登記號MN508948)分別接種在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)30 h，OD600控制在1.2左右，活菌量控制在(1～2)×1011cfu/mL。將4種菌液等體積混合配制成M5備用。IT組使用普通2號蝦料與M5混合均勻后，喂養(yǎng)紅螯螯蝦，蝦料中M5的添加量為當日投食飼料總重量的0.1%，每7 d向蝦池噴灑復合菌劑M5，噴灑量為養(yǎng)殖水量的0.1%。IC組使用普通2號蝦料與IT組等量的MRS和LB培養(yǎng)基混合，并每7 d向蝦池噴灑與IT組等量的MRS和LB培養(yǎng)基。

1.2.3 采樣與測定 實驗前先用自來水洗凈紅螯螯蝦表面并擦干，測量每只紅螯螯蝦濕質量，記為W0，實驗結束后，測定每只紅螯螯蝦的濕質量，記為Wt。采用濕重特定生長率(Specific growth rate，SGR) 作為生長參數，計算實驗前后的養(yǎng)殖密度(Cultural density, CD)。每天定時檢查養(yǎng)殖系統(tǒng)，及時撈出死蝦和殘肢，稱重并記錄，計算存活率(Survival rate, SR)。公式如下：

CD(kg·m-2)=W/S

(1)

式中：W為某一時刻全部個體濕質量和(g)；S為養(yǎng)蝦池面積(m2)；

SGRW(%·d-1)=100%×(lnWt-lnW0)/T(2)

式中：Wt、W0分別為實驗始、末個體濕質量(g)；T為實驗時間(d)；

SR(%)=(存活只數/總只數)×100%

(3)

1.2.4 DNA提取與PCR擴增 用DNA提取試劑盒FastDNASPIN Kit for Soil提取樣品的DNA，通過分光光度計測定最終的DNA濃度并觀察純化效果，1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA質量。通過PCR擴增儀，用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增樣品細菌16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)。PCR反應程序：95 ℃變性3 min，95 ℃；30 s，30個循環(huán)，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃最終延伸10 min。PCR反應在20 μL混合物(5×FastPfu Buffer 4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，338F 0.8 μL，806R 0.8 μL，FastPfu聚合酶 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板 DNA 10 ng，滅菌超純水11.8 μL)中進行，3個重復。

1.2.5 數據分析 將高通量測序結果存儲在NCBI SRA數據庫中(Bioproject登記編號PRJNA573062)，并在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-Sanger平臺中進行分析。為排除測序深度不同帶來的誤差，所有樣本將按最小的序列數量33 434進行抽平，再采用最小序列數33 434對其他樣品進行隨機取樣，形成新的子樣品進行后續(xù)分析。通過Usearch(vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/)對測序結果進行相似水平97%上的OTU劃分。采用RDP貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析。在I-Sanger平臺通過OTU數據進行多樣性分析包括α多樣性分析、樣本比較分析、物種組成分析、物種差異分析以及功能預測分析等。采用IBM SPSS Statistics 25和Origin 2018、相關性分析和線性回歸分析等對其他數據進行處理。顯著性分析包括單因素方差分析、KEGG代謝通路上的G test與Fisher′s分析，其結果含義為顯著：0.01

2 結果與分析

2.1 蝦池水質與養(yǎng)殖情況

實驗期間，紅螯螯蝦特定生長速率、實驗初始和末期的養(yǎng)殖密度見表2。實驗數據表明IC組與IT組的紅螯螯蝦特定生長率均較低，兩組間沒有顯著性差異(P>0.05)。亞成蝦較低的特定生長率可避免實驗周期內紅螯螯蝦生長參數變化過大的影響，符合該研究的重點，利于探究復合菌劑作用的效果及可能的機制。實驗末期(第35天)，IC組與IT組的養(yǎng)殖密度存在顯著性差異(P<0.05)。

表2 養(yǎng)殖情況

圖1 蝦池水質與蝦存活情況Fig.1 Water quality and survival of Cherax quadricarinatu

2.2 腸道菌群的群落結構

在門水平上(圖2a)兩組沒有顯著性的群落組成差異，隨實驗時間的增加，樣品的群落變化主要集中在變形菌門(Proteobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)這4個門中，其總和分別占IT組的(95.53±2.12)%、IC組的(97.36±1.70)%。在OTU水平上，對IT組與IC組的樣本采用Euclidean的距離算法進行PCoA主坐標軸分析(圖2b) ，兩個主坐標軸累積貢獻率達89.7%，說明降維結果具有統(tǒng)計學意義。實驗初期IC組與IT組樣本群落組成相近，但在實驗中期IC組與IT組樣品群落差異較大。實驗末期IC組與IT組群落結構差異又有所減小。在屬水平上，對樣品物種總豐度前50的物種進行Average聚類與熱圖分析，顏色的深淺表示對應的lg(相對豐度)的值(圖2c)，顏色越深，相對豐度越大，白色表示空值。復合菌劑的使用減少了樣品屬水平上的物種豐度，同時減少了弧菌屬(Vibrio)的相對豐度。

圖2 紅螯螯蝦腸道菌群群落組成Fig.2 The composition of intestinal flora of Cherax quadricarinatusc圖中白色表示空值Blank in plot (c) means null value

2.3 菌群與環(huán)境因子的關系

表3 斯皮爾曼相關性分析

圖3 環(huán)境因子與樣品線性回歸圖Fig.3 Linear regression diagram of environmental factors and samples

2.4 腸道菌群的功能分析

使用PICRUSt進行功能預測，得到每個樣品對應的KEGG信息，利用STAMP對IT組與IC組的KEGG代謝通路進行Level 2的分析。選擇兩個樣本進行G test與Fisher′s相結合的檢測方法，進行雙邊檢驗。結果顯示，IC與IT在75.6%的代謝上均有顯著性差異。過濾掉每組相對豐度在0.05%以下的代謝通路，將有顯著性差異(P<0.05)的代謝標出(圖5)。

如圖5所示，IC組和IT組顯著增強的代謝各有不同。其中IT組比IC組顯著減弱的代謝包括：①應對環(huán)境壓迫的代謝類型：膜運輸、細胞運動、細胞生長與死亡、運輸與分解代謝、信號分析和相互作用、環(huán)境適應、異生素的生物降解與代謝、萜類和聚酮類化合物的代謝；②基于碳、氮、磷基本營養(yǎng)元素的代謝類型：脂肪代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、代謝大類、其他氨基酸代謝、其他次生代謝產物的生物合成。

IT組比IC組顯著增強的代謝包括：①有助于宿主的營養(yǎng)方面的代謝，比如能量代謝、輔酶因子和維他命代謝、核苷酸代謝、糖的合成與代謝以及酶家族；②免疫力方面的代謝：傳染性疾病、代謝疾病、免疫系統(tǒng)疾??；③遺傳信息處理與細胞過程的代謝：復制和修復、翻譯、轉錄、遺傳信息處理、折疊，分類和降解、細胞過程和信號。

3 討 論

已知水產養(yǎng)殖動物腸道菌群與養(yǎng)殖水環(huán)境密切相關，一方面水環(huán)境中微生物與水產養(yǎng)殖動物腸道菌群能相互影響[11-12]，另一方面，水質指標比如pH、亞硝態(tài)氮等的改變也會使水產養(yǎng)殖動物腸道菌群發(fā)生變化[13]。因此，養(yǎng)殖水質的調控是水產養(yǎng)殖動物健康的重要環(huán)節(jié)，養(yǎng)殖水體環(huán)境的污染會增加水產養(yǎng)殖動物的致病率，從而引起一系列腸道菌群的動態(tài)變化，而腸道菌群的失衡容易造成水產養(yǎng)殖動物發(fā)病或死亡[13-14]。有研究表明，在健康的凡納濱對蝦腸道中，致病菌的豐度處于較低水平，或與其他微生物的數量保持一定的平衡[15-17]。本研究中紅螯螯蝦腸道內弧菌屬的相對豐度在IT組中大幅減少，這可能在一定程度上解釋了IT組紅螯螯蝦存活率顯著提高的原因?；【撬a生物腸道的常見菌群，其中一些屬于條件致病菌，當其大量定殖于水產養(yǎng)殖動物腸道時，會造成水產養(yǎng)殖動物健康惡化甚至引起死亡[18-19]。而復合菌劑M5中的乳酸菌和枯草芽胞桿菌作為益生成分，可有效抑制致病弧菌的生長，相較于IC組，IT組保持了腸道菌群的平衡。此外，乳酸菌分泌的抗菌物質——細菌素，降低了腸道pH值，可能通過競爭排除作用改變了腸道群落結構[20]，減少了病原菌的生存機會。多項研究表明，飼料中添加乳酸菌和枯草芽胞桿菌可有效防止致病菌爆發(fā)[21-24]。然而，僅憑存活率無法完全判斷宿主的健康情況，后續(xù)的研究應增加對紅螯螯蝦免疫學指標的測試。

圖5 顯著性差異的KEGG 代謝通路Level 2柱形圖Fig.5 Significant difference of groups on KEGG level 2“**”表示顯著性差異(P<0.01)，黑色“**”表示IC組在該代謝通路上相對豐度更高，淺灰色“**”表示IT在該代謝通路上相對豐度更高"**" means significant difference (P<0.01)，black "**" means the IC group has a higher relative abundance on this metabolic pathway, and the light gray "**" indicates the IT has a higher relative abundance on this metabolic pathway

由于微生物含有豐富的菌體蛋白，菌體及其分泌物可作為水產養(yǎng)殖的餌料補充，促進水產養(yǎng)殖動物健康。而水產養(yǎng)殖動物的腸道作為食物儲存、消化和營養(yǎng)吸收的重要器官，在機體免疫中起著重要作用[25-26]。本研究中，IT組中M5的使用為高密度養(yǎng)殖下的紅螯螯蝦提供了額外的營養(yǎng)，緩解了腸道菌群群落間的競爭。具體表現為IT組應對環(huán)境壓迫及基本營養(yǎng)元素的代謝強度顯著低于IC組。M5中的益生成分可能促進了蝦的消化，提高了蝦的免疫能力，使IT組有著更高的存活率，這也與IT組腸道菌群增強的功能代謝結果相符。Du等[27]的研究也得到了相似的結果：使用戊糖乳桿菌(LactobacilluspentosusHC-22)喂養(yǎng)凡納濱對蝦4周后，對蝦的免疫基因表達、免疫酶活性、消化酶活性均顯著高于對照組，改善了蝦的營養(yǎng)，增強了免疫調節(jié)作用。不過，該研究的功能代謝結果是基于功能預測實現的，因此需要其他研究方法，比如轉錄組學方法和代謝組學方法加以證明。

本研究利用復合菌劑M5，改善無交換水的高密度養(yǎng)殖系統(tǒng)下紅螯螯蝦的養(yǎng)殖水體環(huán)境，提高了蝦的存活率，并從腸道菌群以及水質變化兩方面揭示了復合菌劑可能的作用原理與效果。具體結論如下：①通過間歇施加微生物復合菌劑，在有效控制成本的同時，改善了紅螯螯蝦養(yǎng)殖水質，顯著提高了蝦的存活率，減少了水產藥物的使用、提高了飼料利用效率，為水產養(yǎng)殖動物病害防治、免疫預防和綠色生態(tài)養(yǎng)殖提供可靠的保障；②復合菌劑可有效抑制致病弧菌的增殖，平衡了腸道菌群，并作為額外的營養(yǎng)補充，緩解了營養(yǎng)競爭；③基于PICRUSt的功能預測顯示：復合菌劑可提高蝦的免疫力、消化能力，增強蝦的遺傳信息處理與細胞過程的代謝，顯著提高了蝦的存活率。