沈穎越 金群力 宋婷婷 蔡為明* 黃良水 黃彤根 楊建文

工廠化栽培白色和黃色金針菇不同生長階段的胞外酶活性比較

沈穎越1金群力1宋婷婷1蔡為明1*黃良水2黃彤根3楊建文4

（1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，杭州 310021；2. 常山天樂食用菌研究所，浙江 衢州 324200；3. 常山縣金童食用菌專業(yè)合作社，浙江 衢州 324200；4. 江山利興菇業(yè)專業(yè)合作社，浙江 衢州 324100）

以工廠化栽培的白色和黃色金針菇品種為研究對象，對發(fā)菌初期、發(fā)菌中期、滿瓶期、原基期、采收期等5個不同生長階段的胞外酶活性進(jìn)行檢測。結(jié)果：白色品種在整個過程中漆酶活性顯著高于黃色品種，白色品種的堿性和中性蛋白酶活性也高于黃色品種。通過相關(guān)矩陣分析，白色和黃色品種的羧甲基纖維素酶與半纖維素酶活性存在顯著正相關(guān)，中性蛋白酶與堿性蛋白酶活性存在正相關(guān)；中性蛋白酶和堿性蛋白酶與羧甲基纖維素酶和半纖維素酶活性也存在正相關(guān)；白色品種的酸性蛋白酶與堿性蛋白酶活性存在正相關(guān)。

金針菇；胞外酶；活性比較；相關(guān)性分析

金針菇（）是目前世界第四大宗栽培食用菌[1]。其為木腐性真菌，通過分泌各種胞外酶對培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行降解，從中吸收養(yǎng)分。因此，其分泌的半纖維素酶、羧甲基纖維素酶、漆酶和蛋白酶等在不同生長階段的活性對其生長發(fā)育和品質(zhì)有著至關(guān)重要的作用[2]。

前人已對金針菇胞外酶的活性展開多種研究，胞外酶活性也成為栽培者進(jìn)行品種試驗、配方調(diào)整和栽培條件改善等試驗的常用生理指標(biāo)[2-7]。但少有關(guān)于工廠化條件下栽培白色和黃色金針菇在不同生長階段及發(fā)育過程的胞外酶變化研究報道。

本研究以工廠化栽培白色和黃色金針菇品種為對象，對發(fā)菌初期、發(fā)菌中期、滿瓶期、原基期、采收期等5個不同生長階段的胞外酶活性進(jìn)行檢測，通過統(tǒng)計學(xué)分析，揭示其胞外酶活性變化趨勢和規(guī)律，為后續(xù)的品種改良及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃色金針菇菌株（ZAASFy019）和白色金針菇菌株（ZAASFw082），由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供，于同一工廠化基地種植。栽培配方參考文獻(xiàn)[2]。

1.2 取樣

分別對發(fā)菌初期、發(fā)菌中期、滿瓶期、原基期、采收期等5個生長時段的栽培瓶進(jìn)行菌絲取樣（圖1），采收期取樣為剛采收后的樣本。每個時段設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

圖1 不同發(fā)育時期黃色金針菇（A）和白色金針菇（B）取樣

1.3 粗酶液提取

每次取樣時隨機(jī)選取3個菌棒，破碎后混勻，隨機(jī)抽樣5處，以1∶5～10的比例加水配制原樣品，低溫混勻，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，獲得上層澄清液體，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 胞外酶活性測試

半纖維素酶、羧甲基纖維素酶、漆酶、蛋白酶活性測試參考馮偉林等[2]的測定方法。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS22進(jìn)行多重比較，用R3.6.3的Hmisc包進(jìn)行相似性分析，使用corplot包繪制相似性矩陣，相關(guān)性矩陣?yán)L制以< 0.05為閾值繪制。

2 結(jié)果與分析

對比黃色和白色金針菇的半纖維素酶活性（圖2A），兩者在發(fā)菌早期、中期和原基期的差異不顯著，而在滿瓶期和采收期則出現(xiàn)顯著性差異。兩種金針菇在不同生長階段呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，酶活性在發(fā)菌過程中逐漸升高，至原基期降低，采收期復(fù)又升至最高。相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩個菇種的半纖維素酶活性變化呈顯著正相關(guān)關(guān)系（=0.95）。

兩種金針菇的羧甲基纖維素酶活性在發(fā)菌中期、原基期和采收期存在顯著差異，而在發(fā)菌早期和滿瓶期則差異不顯著（圖2B）。兩種金針菇在不同生長階段羧甲基纖維素酶活性的變化趨勢基本一致，發(fā)菌過程中逐漸升高，原基期降至最低，采收期復(fù)又升至最高。相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩個菇種的羧甲基纖維素酶活性變化呈顯著正相關(guān)關(guān)系（=0.96）。

兩種金針菇的漆酶活性在5個不同生長階段的變化趨勢存在顯著性差異（圖2C），其中，白色金針菇酶活性顯著高于黃色金針菇。在發(fā)菌期，白色金針菇酶活性隨時間推進(jìn)而逐漸增加，黃色金針菇則隨時間變化而逐漸減少。在出菇過程中，雖然兩種金針菇酶活性都隨時間而增加，但是白色金針菇增加的幅度顯著大于黃色金針菇。而兩個菇種的漆酶酶活變化則不存在相關(guān)性（=－0.10，=0.72）。

在堿性蛋白酶活性方面，除發(fā)菌早期外，白色金針菇在其他4個生長期均顯著高于黃色金針菇（圖2D）。兩種金針菇在不同生長期該酶活性變化趨勢相似，但存在一定差異，白色金針菇在發(fā)菌過程中呈逐漸上升趨勢，而黃色金針菇在發(fā)菌過程中維持一定水平并有所波動。原基期兩種菇酶活性均下降，采收期均升高至最大值。兩個菇種的堿性蛋白酶活性變化存在正相關(guān)關(guān)系（=0.77，=7.75e-4）。

除發(fā)菌早期和采收期外，白色金針菇在其他3個階段的中性蛋白酶活性顯著高于黃色金針菇（圖2E）。兩種金針菇在不同生長階段的中性蛋白酶活性變化趨勢基本一致，僅有細(xì)微差異。黃色金針菇的酶活性在發(fā)菌期至原基期隨時間變化呈顯著下降趨勢，而白色金針菇則出現(xiàn)波動，在采收期兩種

金針菇酶活性都升至最高。兩個菇種的中性蛋白酶活性變化存在正相關(guān)關(guān)系（=0.92，=7.67e-7）。

兩種金針菇的酸性蛋白酶活性在發(fā)菌期存在顯著差異（圖2F）：在發(fā)菌早期和中期黃色金針菇酶活性高于白色金針菇；滿瓶期則白色金針菇顯著高于黃色金針菇；在原基期和采收期，兩者差異不大。兩種金針菇在栽培過程中的酶活變化趨勢相似，從發(fā)菌期至滿瓶期顯著上升，原基期降低，采收期略有升高。兩個菇種的酸性蛋白酶活性變化存在正相關(guān)關(guān)系（=0.92，=7.54e-7）。

圖2 不同栽培時期白色金針菇和黃色金針菇半纖維素酶（A）、羧甲基纖維素酶（B）、漆酶（C）、堿性蛋白酶（D）、酸性蛋白酶（E）和中性蛋白酶（F）的活性變化

相似性矩陣分析結(jié)果（圖3）顯示，兩種金針菇的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、羧甲基纖維素酶和半纖維素酶的活性，相互間呈顯著正相關(guān)關(guān)系。在黃色金針菇中，酸性蛋白酶活性與羧甲基纖維素酶（=0.55，=0.022），中性蛋白酶與堿性蛋白酶（=0.91，=2.21e-6）、羧甲基纖維素酶（=0.75，=0.0012）、半纖維素酶（=0.84，=0.0001），堿性蛋白酶與羧甲基纖維素酶（=0.79，=0.0004）、半纖維素酶（=0.84，=9.40e-05），羧甲基纖維素酶與半纖維素酶（=0.98，=4.80e-11）之間存在顯著正相關(guān)。在白色金針菇中，酸性蛋白酶與堿性蛋白酶（=0.56，=0.0309917）、漆酶（=0.79，=0.00046），中性蛋白酶與堿性蛋白酶（=0.52，=0.042）、羧甲基纖維素酶（=0.90，=6.03e-6）、半纖維素酶（=0.95，=6.65e-8），堿性蛋白酶與羧甲基纖維素酶（=0.70，=0.0033）、半纖維素酶（=0.63，=0.012），漆酶與羧甲基纖維素酶（=0.68，=0.0049）、半纖維素酶（=0.63，=0.011），羧甲基纖維素酶與半纖維素酶（=0.98，=5.15e-10）之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

圖3 黃色金針菇和白色金針菇6種酶活性的相關(guān)矩陣（P<0.05）

3 結(jié)論與討論

金針菇早已實現(xiàn)高效工廠化栽培。目前，工廠化栽培菌株以日本選育的首潮產(chǎn)量高、生長周期短的白色品種為主導(dǎo)[8, 9]。而黃色金針菇因其外觀色澤豐富、多糖和氨基酸含量高、口感獨特、風(fēng)味濃郁等優(yōu)點備受市場歡迎[10]，但因其首潮產(chǎn)量不高而處于劣勢。本文比較在相同工廠化條件下栽培的黃色和白色金針菇在不同生長階段分泌降解碳源的半纖維素酶、羧甲基纖維素酶和漆酶活性，以及降解氮源的蛋白酶活性及其變化趨勢，為后續(xù)改良黃色金針菇品種提供生理基礎(chǔ)。

結(jié)果顯示，在碳源降解酶類中，白色品種在整個生長過程中漆酶活性顯著高于黃色品種。漆酶是降解木質(zhì)素的重要酶類，因此栽培生產(chǎn)中白色品種的木質(zhì)素降解能力強(qiáng)于黃色品種。對氮源降解，除酸性蛋白酶外，白色金針菇的堿性和中性蛋白酶活性高于黃色品種。金針菇后續(xù)對碳源和氮源營養(yǎng)的汲取將影響其栽培周期、產(chǎn)量和品質(zhì)，因此漆酶和蛋白酶類活性是黃色金針菇工廠化品種選育和篩選的一個重要指標(biāo)。

本文首次對胞外降解酶的變化趨勢之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，通過相關(guān)矩陣，在白色和黃色金針菇的碳源降解酶中，羧甲基纖維素酶與半纖維素酶活性存在顯著正相關(guān)；在氮源降解酶中，中性蛋白酶與堿性蛋白酶活性存在正相關(guān)。白色金針菇的酸性蛋白酶與堿性蛋白酶活性存在正相關(guān)。研究還顯示，碳源降解酶活性變化與氮源降解酶活性也存在一定的正相關(guān)，例如黃色和白色金針菇的中性蛋白酶和堿性蛋白酶活性與羧甲基纖維素酶和半纖維素酶活性存在正相關(guān)。說明金針菇生長發(fā)育過程中，纖維素降解和氮源降解的變化存在一定的協(xié)同性。這為后續(xù)金針菇發(fā)育過程中營養(yǎng)汲取的生理機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果為黃色金針菇工廠化新品種的選育提供適合的胞外酶篩選指標(biāo)，也為金針菇營養(yǎng)汲取機(jī)制的研究提供生理基礎(chǔ)。

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