毛榮良 李 珅 楊 開 李云濤 黃良水 孫培龍*

猴頭菇維生素D2納米脂質(zhì)體的制備與分析

毛榮良1李 珅2楊 開2李云濤1黃良水3孫培龍2*

（1. 常山縣豪鋒農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 衢州 324207；2. 浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，杭州 310014;3. 常山縣天樂食用菌研究所，浙江 衢州 324200）

為提高猴頭菇維生素D2的穩(wěn)定性和生物利用率，以猴頭菇麥角甾醇提取液經(jīng)UVC照射并凍干處理獲得的樣品為原料，制備維生素D2納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體（H-VD2-NLC）和固體脂質(zhì)納米粒（H-VD2-SLN）兩種納米脂質(zhì)載體。經(jīng)測(cè)定不同高壓均質(zhì)循環(huán)次數(shù)下的納米脂質(zhì)體粒徑、聚合物分散性指數(shù)（PDI）、ζ電位、表面形態(tài)、熔點(diǎn)、結(jié)晶點(diǎn)和包封率，發(fā)現(xiàn)H-VD2-NLC和H-VD2-SLN分別在5次和7次高壓均質(zhì)循環(huán)時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，其包封率分別為32.74%±0.18%和10.68%±0.23%，H-VD2-NLC比H-VD2-SLN更適合作為猴頭菇維生素D2納米脂質(zhì)體。

猴頭菇；維生素D2；納米脂質(zhì)體；高壓均質(zhì)；包封率

維生素D（vitamin D，簡(jiǎn)稱VD）包括維生素D2（麥角骨化醇，VD2）和維生素D3（膽骨化醇，VD3）兩種活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)。隨著城市化進(jìn)程的加速和生活方式的改變，居民戶外活動(dòng)時(shí)間日趨減少，進(jìn)而影響到機(jī)體維生素D的合成[1]。VD缺乏是困擾全世界的公共健康問題，目前全球約有10億人攝取不足[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)及營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明：VD缺乏不僅會(huì)引起體內(nèi)鈣磷代謝障礙、佝僂病、軟骨病和骨質(zhì)疏松等骨骼系統(tǒng)疾病，而且還可能引發(fā)癌癥、免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病、代謝性疾?。á蛐吞悄虿『头逝职Y）、肌肉功能障礙和易跌倒等骨外系統(tǒng)疾病[3, 4]。合理補(bǔ)充VD可以降低患病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

雖然化學(xué)合成的VD價(jià)格較為低廉，但人們更偏愛和追求天然健康食品，天然VD不僅價(jià)格高，而且市場(chǎng)份額不斷增大。天然VD2僅存在于真菌界，食用菌中含有豐富的VD2原“麥角固醇”，在紫外光的照射下可轉(zhuǎn)化為VD2，相比海洋生物中的VD3，其更為大多數(shù)素食者所接受。筆者前期對(duì)4種食用菌進(jìn)行紫外光（UV）與脈沖強(qiáng)光（IPL）照射麥角甾醇轉(zhuǎn)化VD2研究[6]，發(fā)現(xiàn)猴頭菇（）經(jīng)短波紫外線（UVC）照射的VD2含量最高。

然而，VD2性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、熱、氧等易降解而失效，導(dǎo)致生物利用率降低，從而限制了其在藥品、食品、保健食品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。有人采用β-環(huán)糊精包埋[7]、添加抗氧化劑[8]或天然植物提取物[9]等方式對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定性保護(hù)研究。納米維生素是通過特殊工藝加工，使脂溶性維生素形成粒徑20～200 nm的分子微團(tuán)，可以乳液等形式對(duì)維生素進(jìn)行包裹，減少降解，極大改善其在水中的溶解性、分散性和透析性能，并能發(fā)揮一定的緩釋功效，促進(jìn)維生素在體內(nèi)的吸收利用[10, 11]。目前，對(duì)VD3納米乳化等的研究較多[11-15]，而關(guān)于VD2納米脂質(zhì)體制備的報(bào)道尚屬少見。

本研究對(duì)猴頭菇麥角甾醇提取液經(jīng)UVC照射處理及凍干后得到的VD2凍干物，采用納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLC）和固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）兩種方式制備猴頭菇納米脂質(zhì)體，并表征其粒徑和ζ-電位等理化性質(zhì)，以期為相關(guān)食用菌VD2劑型及產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇VD2凍干物（H-VD2）的制備方法[6]：將猴頭菇麥角甾醇提取液用UVC照射，然后經(jīng)72 h冷凍干燥獲得。經(jīng)HPLC檢測(cè)，VD2含量為55.7 μg/g。

甘油單硬脂酸酯（GMS）、油酸（OA）、吐溫-80、吐溫-20及三棕櫚酸甘油酯，均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；色譜純甲醇和二氯甲烷，購(gòu)自天津四友化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鉀等其余試劑均為分析純，購(gòu)自上海凌峰試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Alpha 2-4 LD Plus凍干機(jī)，德國(guó)Christ公司；Axiovert 25 CFL光學(xué)顯微鏡，北京瑞科中儀科技有限公司；Tecnai G2 F30透射電鏡（TEM），荷蘭FEI公司；Zetasizer Nano-ZS納米粒度及電位分析儀，英國(guó)Malvern公司；Q20P差示量熱掃描儀，美國(guó)TA儀器，沃特世科技（上海）有限公司；PT-MR2100高速剪切機(jī)，瑞士Kinematica公司；M-110L高壓均質(zhì)機(jī)，美國(guó)Microfluidics公司；Waters1525型高效液相色譜（HPLC）分析儀，美國(guó)Waters有限公司；Cosmosil C18高效液相色譜柱（250 mm×4.6 mm），北京英萊克科技發(fā)展有限公司；ME204E電子天平，梅特勒-托利多精密儀器制造公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-Int150紫外能量計(jì)，深圳致佳儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 H-VD2-NLC的制備

采用Sung等[16]的方法并略作修改，制備猴頭菇VD2納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體（H-VD2-NLC）。

（1）油相制備。準(zhǔn)確稱取2.5 g油酸、6 g甘油單硬脂酸酯于500 mL燒杯中，水浴鍋加熱至60 ℃，準(zhǔn)確稱取0.5 g猴頭菇VD2凍干物溶于其中。

（2）水相制備。準(zhǔn)確稱取170 g雙蒸水、8.5 g吐溫-80活性劑于500 mL燒杯中，水浴鍋加熱至60 ℃。

（3）NLC的制備。將已分別加熱至60 ℃的水相加入到油相中進(jìn)行混合，并使用PT-MR2100高速剪切機(jī)勻化1 min。隨后，將該混合物用M-110 L高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行高壓（75 MPa）均質(zhì)10個(gè)循環(huán)。適量收集每次循環(huán)時(shí)的樣品，以供后續(xù)檢測(cè)。在第10次循環(huán)結(jié)束時(shí)，將熱乳劑立即在冰水浴中冷卻至約0 ℃，制得H-VD2-NLC。

1.3.2 H-VD2-SLN的制備

采用Liedtke等[17]的方法并略作修改，制備猴頭菇VD2固體脂質(zhì)納米粒（H-VD2-SLN）。

（1）油相制備。準(zhǔn)確稱取9.75 g三棕櫚酸甘油酯于500 mL燒杯中，水浴鍋加熱至60 ℃；準(zhǔn)確稱取0.25 g 猴頭菇VD2凍干物溶于其中。

（2）水相制備。準(zhǔn)確稱取180 g雙蒸水、10 g吐溫-20活性劑于500 mL燒杯中，水浴鍋加熱至60 ℃。

（3）脂質(zhì)體的制備。H-VD2-SLN制備方法同1.3.1（3）項(xiàng)。

1.3.3 粒徑和電位測(cè)定

（1）粒徑和Zeta電位。使用Zetasizer Nano-ZS納米粒度及電位ζ分析儀的動(dòng)態(tài)光散射（DLS），在10 ℃下分別測(cè)量H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的粒徑、聚合物分散性指數(shù)和ζ電位。樣品預(yù)處理方法：分別使用蒸餾水對(duì)H-VD2-NLC樣品以1∶9（pH 6.5）和對(duì)H-VD2-SLN樣品以1∶100進(jìn)行稀釋，再分別經(jīng)渦旋振蕩30 s后進(jìn)行粒度分析。

1.3.4 TEM（透射電鏡）分析

采用透射電子顯微鏡（TEM）測(cè)定H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的形態(tài)，在100 kV和80 000倍下成像。樣品預(yù)處理方法如下：

（1）H-VD2-NLC樣品預(yù)處理。將一滴H-VD2-NLC樣品置于銅網(wǎng)上，用濾紙除去過量液體，而后用1%（/）乙酸鈾酰將網(wǎng)格染色3 min，用濾紙吸干多余染色液，靜置風(fēng)干后使用TEM進(jìn)行觀察。

（2）H-VD2-SLN樣品預(yù)處理。將 H-VD2-SLN的樣品以1∶10稀釋，取一滴樣品稀釋液置于銅網(wǎng)上，并滴入2滴2%乙酸鈾酰染色，用濾紙吸干多余染色液，靜置風(fēng)干后使用TEM進(jìn)行觀察。

1.3.5 納米脂質(zhì)體的熔點(diǎn)和結(jié)晶點(diǎn)測(cè)定

采用差示掃描量熱法（DSC）測(cè)定猴頭菇納米脂質(zhì)體的多晶型物及其熔融焓。將8～12 mg樣品（H-VD2-NLC，H-VD2-SLN）置于鋁盤中，并將蓋子密封，以空的密封盤為對(duì)照。將鋁盤放入量熱儀中，在20 ℃下平衡。以10 ℃/min的速度將鍋加熱至120 ℃，分別觀察H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的熔點(diǎn)；以相同的速率冷卻至5 ℃，觀察納米脂質(zhì)體結(jié)晶點(diǎn)。

1.3.6 VD2包封率（encapsulation efficiency，EE）測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）[6]測(cè)定H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的包封率。于25 ℃下，將H-VD2-NLC和H-VD2-SLN在己烷中攪拌2 h，并以10 000 r/min離心10 min。將得到的上清液與甲醇以1∶9（/）比例混合，經(jīng)HPLC法分析游離VD2的含量。包封率（EE）使用以下公式計(jì)算：

式中，T為VD2總量；F為游離的VD2含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑

經(jīng)75 MPa高壓均質(zhì)循環(huán)處理1次，H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的粒徑分別為98.23±3.16 nm和61.11±4.23 nm；當(dāng)高壓均質(zhì)循環(huán)次數(shù)達(dá)到10次時(shí)，H-VD2-SLN的粒徑減小到37.84±3.25 nm，而H-VD2-NLC的粒徑僅減小到60.12±2.37 nm（圖1）。無論是H-VD2-NLC還是H-VD2-SLN，其粒徑均隨著高壓均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的增加而減小，并逐步趨于穩(wěn)定，且H-VD2-NLC的粒徑始終大于H-VD2-SLN的粒徑。所制備的兩種脂質(zhì)體粒徑均在20～200 nm，符合納米脂質(zhì)體的粒徑要求。

圖1 高壓均質(zhì)循環(huán)次數(shù)對(duì)猴頭菇納米脂質(zhì)體粒徑的影響

圖2 高壓均質(zhì)循環(huán)次數(shù)對(duì)猴頭菇納米脂質(zhì)體PDI的影響

圖3 高壓均質(zhì)循環(huán)次數(shù)對(duì)猴頭菇納米脂質(zhì)體ζ-電位的影響

2.2 聚合物分散性指數(shù)（PDI）

由圖2可知，H-VD2-NLC經(jīng)75 MPa高壓循環(huán)均質(zhì)處理1次，PDI為0.351±0.014；隨著均質(zhì)循環(huán)次數(shù)增加，PDI不斷減小，循環(huán)5次時(shí)，PDI降到最小，為0.256±0.013，表明H-VD2-NLC粒徑分布達(dá)到較好均勻狀態(tài)；繼續(xù)均質(zhì)，PDI增大，粒徑的均勻性變差。H-VD2-SLN經(jīng)1次均質(zhì)循環(huán)的PDI為0.487±0.015；其PDI隨著均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的增加而減小，在循環(huán)7次時(shí)出現(xiàn)最小值0.362±0.014，表明H-VD2-SLN粒徑分布達(dá)到較好均勻狀態(tài)；繼續(xù)均質(zhì)，PDI增大，粒徑的均勻性變差。H-VD2-NLC的PDI始終小于H-VD2-SLN，表明其粒徑分布范圍比H-VD2-SLN的窄，粒徑的均勻性更好。

2.3 ζ-電位

如圖3所示，H-VD2-NLC經(jīng)75 MPa高壓均質(zhì)循環(huán)處理1次，ζ-電位為-12.45±0.45 mV；隨著均質(zhì)循環(huán)次數(shù)增加，ζ-電位（絕對(duì)值）不斷增加，循環(huán)5次時(shí)，ζ-電位達(dá)到最大值-14.23±0.44 mV，獲得相對(duì)穩(wěn)定的溶液體系；均質(zhì)循環(huán)次數(shù)繼續(xù)增加，ζ-電位開始減小。H-VD2-SLN的ζ-電位在1次均質(zhì)循環(huán)時(shí)為-9.71±0.34 mV，并隨著均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的增加而增加，循環(huán)7次時(shí)達(dá)到最大值-11.52±0.32 mV，獲得相對(duì)穩(wěn)定的溶液體系，繼續(xù)循環(huán)則ζ-電位減小。在同樣均質(zhì)循環(huán)次數(shù)處理下，H-VD2-NLC的ζ-電位始終大于H-VD2-SLN，表明其具有比H-VD2-SLN更加穩(wěn)定的溶液體系。

2.4 透射電鏡（TEM）

經(jīng)5次高壓均質(zhì)循環(huán)處理的H-VD2-NLC透射電鏡結(jié)果（圖4），此時(shí)H-VD2-NLC由納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包裹，呈現(xiàn)球狀脂質(zhì)體，其中包裹著數(shù)量不等的VD2。H-VD2-NLC粒徑尺寸為72.38±0.11 nm。經(jīng)7次高壓均質(zhì)循環(huán)處理的H-VD2-SLN透射電鏡結(jié)果（圖5），H-VD2-SLN呈不規(guī)則的餅狀和棒狀，粒徑在45.11±0.12 nm左右。

圖4 H-VD2-NLC透射電鏡圖

圖5 H-VD2-SLN透射電鏡圖

2.5 熔點(diǎn)和結(jié)晶點(diǎn)

H-VD2-NLC和H-VD2-SLN經(jīng)前述得到的最佳高壓均質(zhì)條件處理后進(jìn)行DSC測(cè)定的結(jié)果（圖6），經(jīng)5次高壓均質(zhì)循環(huán)處理的H-VD2-NLC結(jié)晶溫度為39.03 ℃，熔融溫度為56.82 ℃；經(jīng)7次高壓均質(zhì)循環(huán)處理的H-VD2-SLN結(jié)晶溫度為37.33 ℃，熔融溫度為64.02 ℃。兩種納米脂質(zhì)體的熔點(diǎn)和結(jié)晶點(diǎn)不同，應(yīng)該是由于采用不同輔料和不同制備方法所致。

A：結(jié)晶循環(huán)；B：熔融循環(huán)。

2.6 包封率（EE）

采用HPLC對(duì)H-VD2-NLC和H-VD2-SLN中的游離VD2進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，經(jīng)5次高壓均質(zhì)循環(huán)處理的H-VD2-NLC包封率為32.74%±0.18%，極顯著高于（＜0.01）經(jīng)7次高壓均質(zhì)循環(huán)處理的H-VD2-SLN包封率（10.68%±0.23%）。因此，相比固體脂質(zhì)納米粒制備方法，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體法更適于猴頭菇納米脂質(zhì)體的制備。但因本研究樣品VD2含量較低，包封率遠(yuǎn)低于用純品VD制備的納米脂質(zhì)載體[13, 16]。

3 結(jié) 論

以猴頭菇麥角甾醇提取液經(jīng)UVC照射并凍干獲得的樣品為VD2原料，通過油酸、甘油單硬脂酸酯和吐溫-80混合制備的H-VD2-NLC和通過三棕櫚酸甘油酯和吐溫-20混合制備的H-VD2-SLN。隨著高壓均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的增多，這兩種納米脂質(zhì)體的粒徑均呈逐漸減小趨勢(shì)，分散性指數(shù)（PDI）呈先降低后增長(zhǎng)的趨勢(shì)，而ζ-電位（絕對(duì)值）則呈先升高后降低趨勢(shì)。

H-VD2-NLC在5次高壓均質(zhì)循環(huán)時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)PDI為0.256±0.013，粒徑為72.38±0.11 nm，包封率為32.74%±0.18%，結(jié)晶溫度為39.03 ℃，熔融溫度為56.82 ℃。H-VD2-SLN在7次高壓均質(zhì)循環(huán)時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)PDI為0.362±0.014，ζ-電位為-11.52±0.32 mV，粒徑為45.11±0.12 nm，包封率為10.68%±0.23%，結(jié)晶溫度為37.33 ℃，熔融溫度為64.02 ℃。在此優(yōu)化條件下，H-VD2-NLC具有比H-VD2-SLN更穩(wěn)定的體系，且包封率是后者的2倍多。后續(xù)將對(duì)H-VD2-NLC的光、熱、氧等的穩(wěn)定性及生物利用率進(jìn)行更深入的研究。

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Preparation Nano-liposome of VD2from

Mao Rongliang1Li Shen2Yang Kai2Li Yuntao1Huang Liangshui3Sun Peilong2*

（1. Changshan Haofeng Agricultural Development Co. LTD, Quzhou, Zhejiang 324207, China; 2. College of Food Science and Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou, Zhejiang 310014, China; 3.Research Institute of Changshan Tianle Edible Fungus, Quzhou, Zhejiang 324200, China）

In order to improve the stability and bioavailability of VD2from, the lyophilized sample of ergosterol extract fromtreated with ultraviolet C irradiation was used as raw VD2materials to prepare two kinds of nano-liposome: the nano-structured liposomes (H-VD2-NLC) and solid lipid nanoparticles (H-VD2-SLN). By analysis number of high pressure homogeneous processing and properties of nano-liposome, including particle size, polymer dispersion index (PDI), zeta potential, surface morphology, melting and crystallization point, encapsulation efficiency, H-VD2-NLC and H-VD2-SLN were found to be a relatively stable state when high pressure homogeneous was five times and seven times, respectively. And at above optimal conditions, the encapsulation efficiency rate of H-VD2-NLC and H-VD2-SLN was 32.74% ± 0.18% and 10.68% ± 0.23%, respectively. In conclusion, H-VD2-NLC was a better alternative than H-VD2-SLN in preparation ofVD2nano-liposome.

; vitamin D2; nano-liposome; high pressure homogeneous; encapsulation efficiency

S646

B

2095-0934（2020）06-440-06

浙江省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019C02040）

毛榮良（1963—），男，農(nóng)技師，常山縣豪鋒農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，主要從事食藥用菌栽培及產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：13867012399@139.com。

孫培龍（1664—），男，教授，浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，主要從事食藥用菌的精深加工研究。E-mail：sun_pl@zjut.edu.cn。