徐秀榮 高志民

(國際竹藤中心 北京 100102)

同源異型盒(Homeobox，HB)基因幾乎在所有的真核生物中廣泛存在，最初是通過果蠅的一個體細胞突變體和同源突變體細胞雜交而獲得的，它參與調(diào)控動物體細胞的位置、形狀和數(shù)量，該基因家族在動物中被分為11個亞類。隨后，不斷從植物和真菌等進化距離較遠的物種中分離出HB基因的同源基因，它們都有一個由60個氨基酸組成的保守DNA結(jié)合域，被稱為同源域(homeodomain, HD)，是該轉(zhuǎn)錄因子家族的特征結(jié)構(gòu)域。HD特有的三維結(jié)構(gòu)包含3個螺旋，其中第2和第3個螺旋形成一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序。植物中有許多HB基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，他們能夠與靶基因的順式調(diào)控區(qū)結(jié)合，在植物生長發(fā)育的各生物學過程中發(fā)揮調(diào)控作用。在植物進化過程中，HB基因分化形成了14個不同的亞類，即BEL、DDT、HD-ZIP I～HD-ZIP IV、KNOX、LD、NDX、PHD、PINTOX、PLINC、SAWADEE和WOX，他們分別具有保守的內(nèi)含子—外顯子結(jié)構(gòu)和各自獨特的特征結(jié)構(gòu)域。

毛竹(Phyllostachysedulis)屬于禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoideae)，具有生長速度快，材性好的特點，毛竹在1個半月內(nèi)可長高20 m左右，是木材的良好替代品。隨著毛竹基因組和基因組數(shù)據(jù)庫的公布，加速了在全基因組水平上的基因鑒定工作，如IQD、SBP-like、TCP、Heat shock和MYB等基因家族的全基因組分析已先后被報道。盡管已在水稻、葡萄、胡蘿卜等多種植物中廣泛開展了HB基因家族的鑒定和功能分析，但對毛竹中HB基因家族的情況及其與木質(zhì)化相關(guān)的功能尚缺乏全面的了解。因此，本研究在全面分析毛竹中HB基因家族成員的分子特征、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、進化關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究了與木質(zhì)素合成相關(guān)的HB蛋白之間的互作，及其靶基因在木質(zhì)化過程中的表達變化，為深入研究HB基因參與調(diào)控木質(zhì)素生物合成的功能，進而揭示竹子木質(zhì)化的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 毛竹HB基因的鑒定

從TAIR 10.0 (https://www.arabidopsis.org/)和RGAP 7.0 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)數(shù)據(jù)庫中分別下載擬南芥和水稻的HB序列，作為種子序列，通過BLAST檢索在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中獲取同源基因序列。然后通過序列比對、保守結(jié)構(gòu)域等分析，剔除冗余序列和保守結(jié)構(gòu)域不完整的序列，保留具有完整HD結(jié)構(gòu)域的序列，并進行下一步研究分析。

1.2 序列分析、基因結(jié)構(gòu)和進化分析

通過Eapasy (http://www.expasy.org/)在線分析毛竹HB家族成員的蛋白質(zhì)分子量、等電點等基本理化性質(zhì)，利用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn)分析毛竹HB家族成員的基因結(jié)構(gòu)，利用MEME (http://meme-suite.org)在線軟件對毛竹HB序列的保守元件進行預測，使用MEGA 7.0軟件對毛竹、擬南芥和水稻的HB序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3 功能預測、共表達網(wǎng)絡(luò)分析和下游靶基因的預測

從PLAZA 4.0數(shù)據(jù)庫(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)獲取毛竹HB蛋白的功能注釋。利用BambooNET數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.cau.edu.cn/bamboo/)對毛竹HB基因家族進行共表達分析。同時，從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中獲取木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵基因PAL、4CL、C3H、C4H、HCT、CCR、CCoAOMT、CAD、F5H、COMT和LAC等的啟動子序列，并分析其是否存在與HB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的特殊DNA結(jié)合位點。

1.4 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組織特異性表達分析

為了探究毛竹HB基因的組織表達特異性，從歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫中下載毛竹葉、早期花序、晚期花序、地下莖、根、20 cm和50 cm高筍的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(ERP001341)；以毛竹HB基因的RPKM值表示基因的表達豐度。為方便統(tǒng)計，對每個表達數(shù)值取以2為底數(shù)的對數(shù)(log2)，經(jīng)均一化后，使用Matrix2png軟件繪制基因表達熱圖。

1.5 毛竹實驗材料

2018年4月份，在江西省南昌市野外毛竹林中，選擇生長良好，基部直徑相近的竹筍為候選材料，分別采集不同發(fā)育階段竹筍(筍高0.2、1.0、3.0和6.7 m)基部為樣品。此外，12月份，用刀切斷竹筍基部“螺絲釘”處的方法挖取毛竹冬筍，選取無病蟲害、無機械損傷、筍體一致的竹筍為材料。將其置于恒溫恒濕室中，任其自然老化，然后在放置0、3、6、12 d時，分別取其基部為樣品。每個樣品至少3次重復，樣品經(jīng)液氮處理后，存儲于-80 ℃冰箱中，用于RNA提取等。另外，取相同樣品固定在FAA中保存于4 ℃冰箱，用于樹脂切片。

1.6 cDNA合成及qRT-PCR分析

使用Takara公司植物總RNA提取試劑盒提取毛竹樣本總RNA，在質(zhì)量和濃度檢測合格后，利用Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，備用。使用Primer 5設(shè)計定量PCR引物，qRT-PCR反應在qTower熒光定量PCR儀進行，反應體系(10.0 μL)如下：2× SYBR Ⅱ Green 1 Master 5.0 μL；正向和反向引物各0.2 μL (10 μM)；cDNA 0.8 μL；H2O 4.0 μL。擴增程序：95 ℃ 6 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，40個循環(huán)。以PeNTB為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。qRT-PCR實驗進行3次生物學重復。

1.7 木質(zhì)素含量測定和組織觀察

木質(zhì)素含量測定：將待測樣本、烘干、磨粉，過40目篩，精確稱取0.1 g，然后參照木質(zhì)素含量測定試劑盒說明書進行測定。木質(zhì)素含量變化的組織化學觀察：將FAA固定液中的毛竹竹筍樣品進行包埋處理，用震蕩切片機進行切片，厚度為20 μm，用0.01%的甲苯胺藍對展片的切片于80 ℃染色3 min，并拍照觀察。

1.8 酵母雙雜交

在共表達分析的基礎(chǔ)上，選擇蛋白-蛋白相互作用(PPI)預測的核心HB，先進行轉(zhuǎn)錄激活活性分析，將基因構(gòu)建到酵母表達載體pGBKT7，分別涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-GAL培養(yǎng)基用于觀察轉(zhuǎn)錄自激活活性，同時以pGBKT7-53 + pGADT7-T和pGBKT7分別做陽性和陰性對照。將無自激活活性的HB基因分別構(gòu)建到pGBKT7和pGADT7載體上，并將重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到酵母菌株AH109，然后涂布在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-GAL培養(yǎng)基上，篩選共表達的陽性克隆。

2 結(jié)果和分析

2.1 PeHBs基因的鑒定與分析

經(jīng)分析比對，在毛竹基因組中共獲得了115個具典型HD結(jié)構(gòu)域的HB家族成員，依次命名為PeHB001～PeHB115?；纠砘再|(zhì)分析結(jié)果顯示，PeHBs基因編碼的蛋白序列差異較大，預測蛋白的長度為197～542 aa；分子量為18.5～58.8 kDa；理論等電點pI介于4.85～9.47。亞細胞定位預測除PeHB043、PeHB060和PeHB080分別定位在線粒體、胞外和質(zhì)膜，其余112個PeHBs均定位在細胞核上。

序列比對結(jié)果表明，115個PeHBs共分為13個亞類 (BEL、DDT、HD-ZIP I～HD-ZI IV、KNOX、NDX、PHD、PINTOX、PLINC、SAWADEE、WOX)，亞類之間序列保守性不高，但每個亞類內(nèi)部成員之間保守性較高。對毛竹(115)、擬南芥(107)和水稻(107)中共獲得的329個HB氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析表明，329個HB共分為14個亞類。多數(shù)亞類均包含毛竹、擬南芥和水稻中的成員，毛竹在各亞類(BEL、DDT、HD-ZIP I～HD-ZI IV、KNOX、PHD、PLINC和 SAWADEE)中的成員數(shù)量與擬南芥和水稻中的相近，表明這些亞類的成員在譜系分化之前都有一個共同的祖先。然而，在WOX亞類中發(fā)現(xiàn)有擬南芥成員16個，水稻成員19個，而毛竹成員只有5個。此外，在LD亞類中沒有發(fā)現(xiàn)毛竹的成員。

2.2 基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

基因結(jié)構(gòu)分析顯示，PeHBs不同成員間存在明顯的多樣性。在115個成員中共發(fā)現(xiàn)了20種不同的外顯子-內(nèi)含子分布模式，PeHBs的內(nèi)含子數(shù)量在0～36之間。PLINC、HD-ZIP I和HD-ZIP II亞類的大多數(shù)成員內(nèi)含子數(shù)量較少，基因的長度較短，而DDT和HD-ZIP III亞類的成員內(nèi)含子數(shù)量較多，基因長度較長。NDX亞類中PeHB078的基因結(jié)構(gòu)最復雜，其序列長度為22 071 bp，包含內(nèi)含子的數(shù)量為36個。此外，同一亞類的大多數(shù)成員都有相似的基因結(jié)構(gòu)，但也有少數(shù)成員例外。例如SAWADEE亞類的3個成員，PeHB094的序列長度為1429 bp，但僅包含一個內(nèi)含子，而PeHB043和PeHB080的序列長度分別為3 651 bp和16 491 bp，包含內(nèi)含子的數(shù)量分別為8個和31個，表明他們的基因結(jié)構(gòu)更加多樣化。

此外，對PeHBs編碼的蛋白進行保守基序分析，共發(fā)現(xiàn)20個保守基序。進一步分析發(fā)現(xiàn)，每個保守基序的氨基酸殘基數(shù)量不同，其中最短的motif 2中包含15個氨基酸，最長的有50個氨基酸，存在于8個motif (motif 3、motif 6、motif 7、motif 10、motif 12、motif 14、motif 18、motif 20)中。其中，motif 1 (GLTPRQVSNWFQNRRARLKKK)含有高度保守的氨基酸(W10和F11)，經(jīng)鑒定motif 1屬于HD保守結(jié)構(gòu)域，存在于95個PeHBs中，占基因總數(shù)的83%。Motif 13、motif 15和motif 16分別為ZIP III、BEL和KNOX亞類所特有。

2.3 PeHBs組織特異性表達分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對PeHBs在毛竹不同組織中的表達模式進行了分析。結(jié)果表明，除PeHB017外，其它114個PeHBs至少在1個組織中表達。此外，90個PeHBs在所有組織中均有表達，但在不同組織間的表達豐度存在明顯差異。例如，BEL亞類的大部分成員在毛竹葉片和花序中表達量較高，而在其他4個組織中表達量相對較低；PLINC亞類成員在毛竹竹筍中相對表達量比其它組織中的高；而HD-ZIP IV亞類成員在根中的表達水平明顯低于其他組織；HD-ZIP III、SAWADEE和NDX亞類中的一些成員，在所有組織中均有較高的表達。此外，同一亞類成員間的表達模式存在差異，例如KNOX亞類中，PeHB054、PeHB057和PeHB084在葉片中高表達，而PeHB051、PeHB058、PeHB074和PeHB100則較低。

2.4 基于GO分析的PeHBs的功能預測

通過GO富集，對PeHBs參與的主要生物學功能進行了分析。結(jié)果表明，在115個PeHBs中具有功能注釋的基因為113個，分別參與了生物學過程、分子功能和細胞成分3大功能，其中有超過65%的PeHBs富集在生物過程當中。此外，“與DNA結(jié)合的特異性序列”(GO:0043565)，“具有轉(zhuǎn)錄因子活性與DNA結(jié)合的特異性序列”(GO:0003700)和“與蛋白結(jié)合”的(GO:0005515)是在分子功能中最常見的注釋條目，表明這些PeHBs編碼的轉(zhuǎn)錄因子具有很強的轉(zhuǎn)錄激活活性，并能夠與特定的DNA結(jié)合來行使功能。在所有分子功能中，調(diào)控“木質(zhì)部發(fā)育”(GO:0010089)和“木質(zhì)部與韌皮部模式形成”(GO:0010051)的PeHBs基因數(shù)量為19個，這些基因用于共表達分析和表達模式分析。

2.5 PeHBs共表達網(wǎng)絡(luò)及PPI預測

為了構(gòu)建與木質(zhì)化相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)，選擇了19個標注為GO:0010089和GO:0010051的PeHBs，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)生成共表達網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果顯示，19個PeHBs中有10個具有共表達相關(guān)性，其中6對基因相互間存在正向共表達，包括PeHB007和PeHB027、PeHB017和PeHB057、PeHB031和PeHB109、PeHB042和PeHB109、PeHB074和PeHB031、PeHB074和PeHB109；唯一的負向共表達基因?qū)κ荘eHB005和PeHB095。這表明，共表達的PeHBs可能共同參與調(diào)控毛竹細胞壁的木質(zhì)化。

為了研究毛竹中19個PeHBs與其它蛋白的相互作用，構(gòu)建了一個PPI網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點代表PeHBs和其它轉(zhuǎn)錄因子，邊緣是2個蛋白的相互作用。根據(jù)節(jié)點之間的連接，可以將18個節(jié)點明確地分為2組。在一組中，18個節(jié)點中有15個連接，其中包含8個PeHBs(4個KNOX類成員和4個BEL類成員)和3個KNOX類成員是與其他PeHBs和TFs(如MYB、bHLH、OVATE等)相互作用的核心蛋白。另一組僅包含3個節(jié)點和2條邊，表示PeHB005與PeMYB1和PeMYB16相互作用。研究表明，水稻中MYB、bHLH和OVATE與木質(zhì)素合成有關(guān)，這意味著毛竹中木質(zhì)素合成的調(diào)控是一個包含多種轉(zhuǎn)錄因子的復雜網(wǎng)絡(luò)。

2.6 PeHBs轉(zhuǎn)錄活性及互作關(guān)系驗證

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中KNOX亞類的4個成員(PeHB057、PeHB058、PeHB072和PeHB100)，克隆其完整的ORF區(qū)域并測序確認，然后構(gòu)建到pGBKT7載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到AH109酵母細胞中，而后在缺陷型培養(yǎng)基上進行了檢測。結(jié)果表明，陽性對照能夠在“一缺”和“三缺”的培養(yǎng)基上生長，并在“三缺”培養(yǎng)基中菌落變藍，而KNOX亞類的4個成員轉(zhuǎn)化到pGBKT7后在“三缺”培養(yǎng)基上不變藍，表明KNOX亞類的4個成員沒有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

為了研究不同PeHBs之間的PPI，選取預測網(wǎng)絡(luò)中的PeHB037 (BEL亞類)和PeHB057 (KNOX亞類)，使用酵母雙雜交系統(tǒng)進行驗證。結(jié)果表明，AD-PeHB037和BD-PeHB057共轉(zhuǎn)到AH109酵母細胞后在“二缺”培養(yǎng)基上生長良好，在加了X-α-GAL的“四缺”培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-GAL上與陽性對照表現(xiàn)一致，均變藍色。由此表明，PeHB037與PeHB057在酵母細胞中存在蛋白互作關(guān)系，在毛竹中具有調(diào)控功能。

2.7 與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的PeHBs的表達模式分析

為了解19個與次生細胞壁相關(guān)的PeHBs的功能，利用qRT-PCR對毛竹不同高度筍中及冬筍采后自然老化過程中PeHBs的表達模式進行了分析。結(jié)果表明，隨著竹筍高度的增加大多數(shù)PeHBs的表達量隨之增加。BEL和KNOX亞類的所有成員在6.7 m高度筍的表達量高于0.2 m筍中的表達量，尤其是PeHB042、PeHB109、PeHB017和PeHB057分別顯著上調(diào)147、683、321和465倍。WOX亞類中的PeHB019和PeHB070表現(xiàn)出相似的趨勢，都是先增加后減少，最終在6.7 m筍中的表達量達到最大值。ZIP亞類中除了PeHB005是下調(diào)之外，其他所有成員的表達趨勢均為上調(diào)。另外研究發(fā)現(xiàn)，19個PeHBs在25 ℃貯藏的冬筍中的表達模式與不同高度筍中的類似，PeHB005是唯一顯著下調(diào)的基因。這些PeHBs表達變化以及不同PeHBs之間的表達量差異，表明他們對竹子的木質(zhì)素生物合成調(diào)控作用存在著一定的差異，從而不同程度地影響其木質(zhì)化進程。

2.8 毛竹筍在不同儲藏時間下的木質(zhì)化分析

竹筍是竹子未成熟的莖，筍在隨著生長高度的增加以及儲存時間延長的過程中均會發(fā)生木質(zhì)化。木質(zhì)化過程的主要特征是木質(zhì)素在細胞壁的沉積，這已在不同高度的筍的實驗研究中得到證實。因此，本實驗將收集到的25 ℃貯藏條件下的冬筍，分別在儲存0、3、6、12 d時進行木質(zhì)素變化的分析。組織化學染色結(jié)果顯示，隨著貯藏天數(shù)的增加，冬筍維管束的染色面積和著色深度逐漸增大；同時，冬筍中木質(zhì)素的含量也有所增加。貯藏12 d時木質(zhì)素含量為22.38%，明顯高于對照(9.38%)(P< 0.05)。木質(zhì)素的增加與大多數(shù)PeHBs (19個PeHBs中的14個)在冬筍中的表達量增加趨勢是一致的。這些結(jié)果表明，冬筍在儲藏過程中木質(zhì)化程度不斷加深，而PeHBs基因表達變化恰好說明了他們可能以不同程度參與調(diào)節(jié)筍木質(zhì)素的生物合成調(diào)控，進而影響木質(zhì)化的過程。

2.9 與木質(zhì)素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因在竹筍木質(zhì)化過程中的表達

對木質(zhì)素生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因啟動子序列的分析發(fā)現(xiàn)，在Pe4CL(PH01000809G0020)、PeC3H(PH01001724G0360)、PeCCR(PH01001334G0240)和PeCOMT(PH01001283G0360)4個基因的啟動子均存在KNOX的DNA結(jié)合位點(TGACAGC)，表明他們可能是受KNOX的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。qRT-PCR結(jié)果顯示，Pe4CL、PeC3H、PeCCR、PeCOMT的表達量隨著木質(zhì)化程度的增加而明顯增加。特別是PeCOMT在6.7 m高筍的表達量比0.2 m高時顯著增加了53倍，而在冬筍儲藏12 d時的表達量是鮮筍的122倍。在不同高度筍中4個木質(zhì)素合成基因與5個KNOX基因的表達呈正相關(guān)；在竹筍儲存過程中與3個PeHBs (PeHB017、PeHB057和PeHB074)的表達呈正相關(guān)，這為PeHBs通過調(diào)節(jié)木質(zhì)素生物合成基因來參與木質(zhì)化過程的調(diào)控提供了有力的證據(jù)。

3 討論

HB基因在植物中普遍存在，在調(diào)節(jié)細胞分化、胚芽分生組織形成、胚胎模式形成、維管發(fā)育、花器官發(fā)生、果實成熟等方面發(fā)揮著重要作用。因此，開展毛竹HB基因的鑒定與表達研究，將有助于揭示其在毛竹生長發(fā)育中的調(diào)控功能。

3.1 基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域可能與基因功能相關(guān)

在毛竹中有94個PeHBs (占總數(shù)的85%)的內(nèi)含子數(shù)量少于10個，只有21個PeHBs的內(nèi)含子數(shù)量多于10個。在同一亞類中內(nèi)含子的數(shù)量是相近的。例如，ZIP I類的成員有1個或2個內(nèi)含子，而ZIP III類的成員比ZIP I、II和IV類包含更多的內(nèi)含子，但他們是相對保守的，與葡萄中內(nèi)含子的情況類似。一般來說，外顯子或內(nèi)含子的得失可能是造成功能差異的主要原因，會使基因的功能多樣化。在115個PeHBs中發(fā)現(xiàn)了20個高度保守的基序，每個亞類當中不同的基序是保守的并且分布也是相似的。此外，這些基序在進化過程中高度保守，暗示可能與其功能保守性有關(guān)。

3.2 PeHBs在不同組織中的表達模式具有多樣性

根據(jù)PeHBs在毛竹不同組織和不同發(fā)育階段的表達差異，發(fā)現(xiàn)他們具有不同的組織表達特異性。例如，HD-ZIP III、SAWADEE、NDX等亞類的成員在所有組織中均有高表達，表明他們可能參與了多種生物學過程，在毛竹的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。而PeHB017在所有組織中表達水平都非常低，這表明他可能參與了其他的生物學過程。PHD和HD-ZIP IV亞類中部分PeHBs在根中的表達水平明顯低于其他組織，表明他們參與根生長發(fā)育的作用較小。BEL亞類的大部分成員在葉片和花序中表達量較高，但在其他4種組織尤其是筍中較低。此外，PLINC亞類的PeHBs在竹筍中表達占主導地位，在其他組織中相對較低。

3.3 19個PeHBs在毛竹筍木質(zhì)化過程中起重要作用

在自然條件下，隨著筍生長高度的增加，以及在室溫條件下隨著貯藏時間的延長，竹筍的木質(zhì)化程度都是增加的。除PeHB005外，其余18個PeHBs的表達量隨筍高度增加和儲存時間延長最后均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢。然而，上調(diào)的PeHBs表現(xiàn)出不同的表達模式。例如8個PeHBs的表達豐度呈現(xiàn)不斷上升的模式，說明這些基因在木質(zhì)化過程中發(fā)揮著正調(diào)控作用。同時，5個上調(diào)基因表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，表達量的最大值分別出現(xiàn)在1.0 m或3.0 m高度筍和儲存3 d或6 d后的冬筍中。PeHB005是貯藏期間以及不同高度筍木質(zhì)化過程中唯一下調(diào)的基因。這些結(jié)果表明，木質(zhì)化過程是一個與由多個PeHBs有關(guān)的復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3.4 PeHBs組成木質(zhì)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

植物木質(zhì)化是一個與細胞分化和發(fā)育相關(guān)，并且由許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和功能基因共同表達驅(qū)動的復雜的生物學過程。有研究表明，KNAT7與BLH6相互作用，在次生細胞壁形成中起抑制作用。在本研究中，KNOX類(PeHB074)和BEL類中的2個成員(PeHB031、PeHB109)在互作網(wǎng)絡(luò)中呈正向共表達，這與他們在筍木質(zhì)化過程中表達結(jié)果相一致。本研究在Pe4CL、PeC3H、PeCCR和PeCOMT的啟動子中均發(fā)現(xiàn)了KNOX的結(jié)合位點，并且3個KNOXs與這些木質(zhì)素合成基因呈現(xiàn)正向共表達關(guān)系。根據(jù)PeHBs構(gòu)成的共表達網(wǎng)絡(luò)、蛋白間互作關(guān)系以及對下游結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控作用，表明毛竹木質(zhì)化過程是一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié)論

從毛竹中鑒定出115個PeHBs，分為13個亞類。有19個PeHBs被預測與木質(zhì)素生物合成相關(guān)，其中10個PeHBs具有共表達相關(guān)性。隨著木質(zhì)化程度增加，在不斷生長的筍和室溫貯藏的筍中19個PeHBs的表達模式是相似的，其中3個KNOX亞類的PeHBs與4個木質(zhì)素合成基因(Pe4CL、PeC3H、PeCCR和PeCOMT)的表達呈正相關(guān)。PPI預測KNOX亞類的3個PeHBs是與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的樞紐蛋白，PeHB037與PeHB057在酵母中互作驗證了這一點。由此表明，PeHBs參與毛竹木質(zhì)素生物合成，通過形成一個多層次的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響其木質(zhì)化過程。

原 文 出 處

Xu X R, Lou Y F, Yang K B, Shan X M, Zhu C L, Gao Z M. Identification of homeobox genes associated with lignification and their expression patterns in bamboo shoots. Biomolecules. 2019. 9, 862. DOI: 10.3390/biom9120862.