李俊明，徐煒

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.江西省醫(yī)療服務(wù)指導(dǎo)中心，江西 南昌 330006）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb） 感染導(dǎo)致的一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的感染性疾病。世界衛(wèi)生組織（WHO）最新的研究報(bào)告顯示，盡管結(jié)核病疫情已得到一定的遏制，全球每年仍有約1000 萬(wàn)的新發(fā)病例, 約100-140萬(wàn)人死于結(jié)核病。尤其值得警惕的是，結(jié)核病的耐藥形勢(shì)日益嚴(yán)峻。目前, 大約3.3%的新發(fā)病例和17.7%的經(jīng)治復(fù)發(fā)病例為耐多藥結(jié)核病（即同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥）[1]，而研究顯示，相對(duì)于初治和非耐多藥的復(fù)治結(jié)核病患者83%的治愈率，耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病治療的成功率顯著降低，分別為54%和30%[2]。

早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者并給予有效的治療是控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，結(jié)核病的診斷主要基于臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查。由于結(jié)核病,尤其是肺外結(jié)核的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征均不是很典型,實(shí)驗(yàn)室檢查在結(jié)核病的診斷中發(fā)揮重要作用。目前，結(jié)核病診斷和藥敏分析應(yīng)用最廣泛的方法仍然是細(xì)菌學(xué)方法,主要包括痰涂片抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培的培養(yǎng)。痰涂片抗酸染色的敏感性差,且無(wú)法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。培養(yǎng)法的敏感性較痰涂片抗酸染色有顯著提高，但耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，一般需要3～4 周獲得陽(yáng)性結(jié)果, 如果加上藥敏分析的時(shí)間通常需要6～8 周時(shí)間。細(xì)菌學(xué)檢查的這些不足極大地限制了結(jié)核病的及時(shí)診斷和藥敏分析。WHO 估計(jì)，目前全球每年約有300 萬(wàn)的結(jié)核病患者因未獲得診斷而被遺漏[1]，而且，即使在獲得細(xì)菌學(xué)確診的結(jié)核病患者中也僅有三分之一進(jìn)行了藥敏分析檢測(cè),大多數(shù)患者接受的是經(jīng)驗(yàn)性的治療。因此，快速而準(zhǔn)確的結(jié)核病診斷新技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用對(duì)于結(jié)核病的診斷和治療,以及全球結(jié)核病疫情的防控均具有重要意義。

近年來(lái),分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展給結(jié)核病的早期診斷和快速藥敏分析產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用,一系列新的分子診斷技術(shù)正在或即將進(jìn)入臨床應(yīng)用。目前，已有多種分子診斷平臺(tái)經(jīng)過(guò)了WHO的論證并獲得WHO 的推薦，另外還有多種新近發(fā)展的分子診斷平臺(tái)雖未獲得WHO 推薦但已經(jīng)獲批在臨床應(yīng)用,這些分子診斷技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用有望進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)核病的臨床診斷和藥敏分析能力，同時(shí)大大縮短檢測(cè)時(shí)間，促進(jìn)結(jié)核病的早期診斷和合理治療。

1 基于核酸擴(kuò)增試驗(yàn)的結(jié)核病診斷及藥敏分析技術(shù)

基于核酸擴(kuò)增試驗(yàn) （nucleic acid amplification tests, NAATs) 的結(jié)核病診斷技術(shù)是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) （polymerase chain reaction, PCR)對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性基因序列或耐藥相關(guān)基因進(jìn)行靶向擴(kuò)增和分析,借以對(duì)結(jié)核病進(jìn)行診斷和耐藥性分析的技術(shù)。NAATs 最主要的特點(diǎn)是具有很高的檢測(cè)敏感性，同時(shí)檢測(cè)速度快，是目前應(yīng)用最為廣泛的結(jié)核病分子診斷技術(shù)。

1.1 Xpert MTB/RIF 和 Xpert MTB/RIF Ultra 系 統(tǒng)Xpert MTB/RIF 檢測(cè)系統(tǒng)以Mtb 的rpoB 基因?yàn)榘袠?biāo), 通過(guò)熒光定量PCR 技術(shù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增后采用分子信標(biāo)技術(shù)對(duì)其中與利福平（rifampicin，RIF）耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)M tb 進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)RIF 耐藥基因型進(jìn)行分析[3]。Xpert的主要特點(diǎn)是具有良好的檢測(cè)敏感性和特異性，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短和生物安全性好等優(yōu)點(diǎn),也因此于 2010 年獲得了 WHO 的推薦[4]。大量的研究顯示，Xpert MTB/RIF 對(duì)結(jié)核病診斷的整體敏感性和特異性分別達(dá)85%和98%,對(duì)于痰涂片抗酸染色陰性標(biāo)本的檢測(cè)敏感性也可達(dá)到70%,同時(shí)其在RIF 耐藥性分析方面也具有優(yōu)秀的表現(xiàn)，敏感性和特異性分別達(dá)96%和98%[5-7]。然而也有研究顯示, 在結(jié)核病疫情低發(fā)的國(guó)家和地區(qū),Xpert MTB/RIF 檢測(cè)的敏感性并不理想[8]。

為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的敏感性，美國(guó) Cepheid公司推出了第二代Xpert 檢測(cè)系統(tǒng),即Xpert Ultra。Xpert Ultra 采用了更大的 DNA 擴(kuò)增倉(cāng)和兩個(gè)額外的分子靶標(biāo)（IS6110 和 IS1081）來(lái)檢測(cè) Mtb，同時(shí)將高分辨融解曲線分析技術(shù)應(yīng)用于RIF 耐藥基因型的檢測(cè), 從而進(jìn)一步提高了其檢測(cè)的敏感性,使其最低檢測(cè)限達(dá)到16CFU/mL, 同時(shí)保留了對(duì)rpoB 基因突變檢測(cè)的高敏感性和高特異性[9,10]。研究結(jié)果顯示，Xpert Ultra 檢測(cè)Mtb 的整體檢測(cè)敏感性可達(dá)88%, 同時(shí)顯著地提高了對(duì)于兒童結(jié)核和HIV 感染者合并結(jié)核病的檢測(cè)敏感性。因此，WHO在2017 年推薦將Xpert Ultra 系統(tǒng)用于成人和兒童結(jié)核病的首診檢測(cè),包括HIV 感染合并結(jié)核病的診斷[11]。然而，檢測(cè)敏感性的提高在一定程度上降低了Xpert Ultra 檢測(cè)的特異性。雖然從整體上來(lái)看由此導(dǎo)致的特異性下降并不是很明顯 （從98%下降至96%）,但研究證實(shí)其對(duì)HIV 合并Mtb 感染的患者和結(jié)核病復(fù)發(fā)患者等特定群體的檢測(cè)性能有較明顯的影響,可顯著降低其檢測(cè)的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值[12]。

目前 Xpert MTB/RIF 和 Xpert MTB/RIF Ultra系統(tǒng)已在全球數(shù)十個(gè)國(guó)家獲得了較廣泛的應(yīng)用,在結(jié)核病的診斷和耐藥性分析方面發(fā)揮了非常積極的作用。然而，Xpert 檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用也存在一些不足, 除了因檢測(cè)敏感性問(wèn)題導(dǎo)致部分漏診外,在RIF 耐藥性分析方面也存在一定程度的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果, 如可能出現(xiàn)因rpoB 基因無(wú)義突變?cè)斐蒖IF 假性耐藥的結(jié)果[13],也可能因Mtb 存在rpoB熱點(diǎn)突變區(qū)域以外的RIF 耐藥相關(guān)基因突變而導(dǎo)致假性RIF 敏感的結(jié)果[14]。此外,由于大多數(shù)對(duì)RIF耐藥的Mtb 會(huì)同時(shí)對(duì)異煙肼（isoniazid，INH）耐藥，因此很多研究者利用Xpert 進(jìn)行耐多藥結(jié)核病的檢測(cè)或推測(cè)。然而，有研究顯示有約40%對(duì)RIF 耐藥的患者對(duì)INH 是敏感的[15]，在對(duì)RIF 敏感的患者中也有約27%的患者對(duì)其它一線抗結(jié)核藥是耐藥的[16]。因此，在采用Xpert 系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)核病診斷和耐藥性分析時(shí)應(yīng)注意其應(yīng)用的范圍。

1.2 基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的結(jié)核病診斷技術(shù) 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一類(lèi)在恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)，根據(jù)引物設(shè)計(jì)方法、采用的聚合酶和解鏈條件的不同又可分分環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)、交叉引物擴(kuò)增（crossing priming amplification，CPA）技術(shù)和核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技術(shù)等。與常規(guī) PCR 比較，恒溫?cái)U(kuò)增具有操作簡(jiǎn)單、擴(kuò)增效率高、報(bào)告時(shí)間短和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)由于不需要經(jīng)歷不同的溫度循環(huán)，無(wú)需復(fù)雜昂貴的DNA 擴(kuò)增儀，非常適合在貧困地區(qū)和基層實(shí)驗(yàn)室使用[17]。

LAMP 技術(shù)是目前唯一通過(guò)WHO 的技術(shù)驗(yàn)證并獲得WHO 推薦應(yīng)用的基于等溫?cái)U(kuò)增的結(jié)核病快速診斷技術(shù),已在多個(gè)國(guó)家獲得了較廣泛的應(yīng)用[18]。LAMP 借助具有鏈置換功能的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA 聚合酶和至少4 條引物在60～65℃條件下完成DNA 擴(kuò)增過(guò)程,具有極高的擴(kuò)增效率，可在60 分鐘內(nèi)完成擴(kuò)增并通過(guò)可視化的方式 （熒光或濁度改變等） 呈現(xiàn)結(jié)果。WHO 的驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，LAMP 技術(shù)在結(jié)核病診斷方面具有良好的敏感性76%～80%和特異性 97%～98%[18]。

其它的一些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)雖未經(jīng)WHO 驗(yàn)證，但已有多種獲批在臨床上應(yīng)用,這些技術(shù)雖同為等溫?cái)U(kuò)增,但根據(jù)引物設(shè)計(jì)和解鏈方式的不同各具特點(diǎn)[19]，如基于核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增技術(shù)的同步擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(Simultaneous amplification and testing,SA T-TB) 以Mtb 特異性的16s rRNA 為擴(kuò)增靶標(biāo)，可特異性檢測(cè)標(biāo)本中存活狀態(tài)的Mtb，可有效避免死菌的存在對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。這一特點(diǎn)對(duì)經(jīng)治結(jié)核病患者的準(zhǔn)確診斷具有更好的特異性， 且具有監(jiān)測(cè)結(jié)核病治療效果的潛力[20]。

1.3 基于數(shù)字PCR 的結(jié)核病診斷和藥敏檢測(cè)技術(shù)數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)是一種新近建立的單分子核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理是將含有DNA 模板的PCR 溶液稀釋后分布到大量的獨(dú)立反應(yīng)室,使單個(gè)的模板DNA 分子在各自獨(dú)立的反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,再在擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集,最后通過(guò)直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式計(jì)算得到樣品的原始濃度或含量。由于各DNA 模板在獨(dú)立的反應(yīng)單元中進(jìn)行擴(kuò)增，因此dPCR 具有極高的分辨率和靈敏度,同時(shí)由于可在不依賴(lài)內(nèi)標(biāo)的條件下實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，dPCR 技術(shù)可準(zhǔn)確地計(jì)算出野生型和突變型基因的比例[21],這些特點(diǎn)使dPC R 在突變基因檢出方面具有極佳的性能，可以在耐藥相關(guān)基因的檢測(cè)方面發(fā)揮獨(dú)特的作用。

在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因型的判斷中,如果在菌群中存在1%以上的菌株同時(shí)對(duì)INH 和RIF 耐藥即可定義為耐多藥結(jié)核,并在臨床中表現(xiàn)出耐多藥結(jié)核的表型[22]，這種因少數(shù)耐藥菌存在導(dǎo)致的耐藥現(xiàn)象被稱(chēng)為異質(zhì)性耐藥[23]。研究顯示，在結(jié)核病高發(fā)地區(qū)有9%～20%的臨床分離菌株中存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象[24]，而現(xiàn)有的核酸分子雜交技術(shù)和常規(guī)PCR 技術(shù)都難以檢測(cè)到5%以下的突變分子，因此在耐藥基因型的檢測(cè)方面存在一定的局限，而dPCR 可以借助其高靈敏度和高分辨率的優(yōu)勢(shì)檢出低至0.1%的突變分子。菌株水平的研究證實(shí)，dPCR 可檢測(cè)出低至1CFU/μL 的Mtb, 并可在野生型基因片段中檢出低至0.1%的結(jié)核病耐藥相關(guān)基因[25]，表現(xiàn)出極好的檢測(cè)異質(zhì)性耐藥的性能。應(yīng)用臨床標(biāo)本對(duì)結(jié)核病進(jìn)行肺結(jié)核和肺外結(jié)核診斷的臨床研究也證實(shí)，dPCR 具有優(yōu)于常規(guī)PCR 的檢測(cè)敏感性和特異性[26,27]。研究同時(shí)證實(shí)，利用dPCR 技術(shù)可很好地檢出結(jié)核病患者外周血中Mtb 的循環(huán)游離DNA, 其檢測(cè)的敏感性和特異性均顯著優(yōu)于常規(guī)的熒光定量PCR 技術(shù), 這對(duì)于兒童結(jié)核病和肺外結(jié)核病的診斷具有很好的實(shí)用價(jià)值,因?yàn)檫@些患者常常無(wú)法獲取痰標(biāo)本[28,29]。同時(shí)，由于可對(duì)標(biāo)本中的核酸分子進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，dPCR 還可用于監(jiān)測(cè)結(jié)核病患者的治療反應(yīng)性, 從而指導(dǎo)臨床的治療,這對(duì)于接受經(jīng)驗(yàn)性治療的患者尤其具有重要意義。然而，目前dPCR 在臨床中的應(yīng)用還遠(yuǎn)未普及，WHO 也還未對(duì)該技術(shù)在結(jié)核病診斷和藥敏檢測(cè)中的有效性組織論證,其中很重要的原因之一可能在于dPCR 檢測(cè)需要昂貴的設(shè)備，檢測(cè)成本也顯著高于常規(guī)的NAATs 技術(shù)。

1.4 其它NAATs 技術(shù) 作為核酸擴(kuò)增和檢測(cè)的最主要技術(shù)平臺(tái)，PCR 主要的特點(diǎn)之一就是可以不斷的推陳出新,在此基礎(chǔ)上衍生出各種具有不同特點(diǎn)的核酸擴(kuò)增和檢測(cè)方法,在結(jié)核病分子診斷領(lǐng)域也充分展示出了PCR 技術(shù)平臺(tái)的這一特點(diǎn)。近年來(lái)，一系列基于PCR 技術(shù)的NAATs 檢測(cè)系統(tǒng)不斷地被開(kāi)發(fā)出來(lái)并用于結(jié)核病的診斷和藥敏分析，其中比較具有代表性的包括基于多重?zé)晒舛縋CR 技術(shù)的 Abbott RealTimeMTB 和 Abbott RealTimeTMRIF/INH 檢測(cè)系統(tǒng)，基于不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增和線性指數(shù)PCR (linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)技術(shù)的 Hain FluoroTypeMTB 和 Hain FluoroTypeMTDBR 檢測(cè)系統(tǒng)， 基于多靶標(biāo)熒光定量PCR 技術(shù)的Roche CobasMTB 系統(tǒng)和PCR擴(kuò)增結(jié)合熒光探針融解曲線分析的MeltProTB檢測(cè)系統(tǒng)等。這些檢測(cè)系統(tǒng)大多可以同時(shí)進(jìn)行Mtb檢測(cè)和藥敏分析，而且，與現(xiàn)有的WHO 推薦的方法比較具有更高的檢測(cè)通量，如Abott RealTime 檢測(cè)系統(tǒng)每批次可檢測(cè)96 份標(biāo)本，且具有良好的檢測(cè)性能,在Mtb 檢測(cè)方面的敏感性和特異性分別為96%和97%，檢測(cè)RIF 耐藥性的敏感性和特異性分別為94%和100,檢測(cè)INH 耐藥性的敏感性和特異性分別為89%和99%[30]。2019 年WHO 成立了一個(gè)專(zhuān)門(mén)的技術(shù)小組對(duì)這些高通量的分子診斷平臺(tái)進(jìn)行相關(guān)性能的論證, 初步的結(jié)果顯示這些平臺(tái)在Mtb 檢測(cè)方面的性能與Xpert 相近，在檢測(cè)耐多藥結(jié)核病的性能方面與線性探針技術(shù)相近， 但技術(shù)小組的報(bào)告認(rèn)為目前還未得到足以支持推薦這些檢測(cè)平臺(tái)的足夠數(shù)據(jù)[31]，因此盡管上述部分檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)得到相關(guān)政府管理部門(mén)的批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，但主要還局限于科研實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用，但目前，WHO 已計(jì)劃成立一個(gè)指南開(kāi)發(fā)小組對(duì)這些技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行第二輪的論證[1]。

2 基于核酸分子雜交技術(shù)的結(jié)核病藥敏檢測(cè)技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是基于具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下可按堿基配對(duì)原則形成雙鏈分子的原理,將待檢分子與已知序列的核酸分子進(jìn)行雜交反應(yīng),再通過(guò)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)技術(shù)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和分析的技術(shù)。如果在進(jìn)行雜交反應(yīng)前對(duì)已知序列的核酸分子,即核酸分子探針進(jìn)行標(biāo)記即可在雜交反應(yīng)后對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)分析與不同探針?lè)肿影l(fā)生雜交后的信號(hào)進(jìn)行分析即可了解待檢標(biāo)本中存在的核酸分子的信息。核酸分子雜交技術(shù)最主要的優(yōu)勢(shì)是其具有強(qiáng)大的多靶標(biāo)分析能力,理論上通過(guò)設(shè)計(jì)合適的探針可用于幾乎所有突變形式的檢測(cè)。隨著固相載體材料和點(diǎn)樣技術(shù)的不斷發(fā)展,分子雜交檢測(cè)的高度集成的優(yōu)勢(shì)越發(fā)顯著,使得其在核酸分子檢測(cè)中的效率越來(lái)越高。目前，分子雜交技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各類(lèi)核酸分子,尤其是突變分子或SNP 的檢測(cè)與分析。通常，而為了提高核酸分子雜交檢測(cè)的靈敏度,核酸分子雜交多與PCR 技術(shù)結(jié)合使用，即首先通過(guò)PCR 技術(shù)對(duì)標(biāo)本中的待檢核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增,再采用特異性的探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交分析。

由于結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制絕大多數(shù)與染色體核酸分子的突變有關(guān),且絕大多數(shù)與Mtb 耐藥相關(guān)的基因突變類(lèi)型已經(jīng)明確,因此核酸分子雜交在Mtb 耐藥性檢測(cè)方面有很好的應(yīng)用價(jià)值,目前已有多種基于核酸分子雜交的技術(shù)平臺(tái)應(yīng)用于結(jié)核病的診斷和耐藥分析。早在2008 年，WHO 就推薦采用線性探針?lè)治龇?Line probe assay, LPA)對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行RIF 和INH 的耐藥性檢測(cè), 這也是WHO 最早推薦使用的結(jié)核病分子診斷技術(shù)[32]。線性探針?lè)治龇ㄊ腔诜聪螂s交的原理, 采用靶向Mtb 23S rRNA 基因的探針進(jìn)行Mtb 的檢測(cè), 采用靶向rpoB 的多條探針檢測(cè)RIF 耐藥相關(guān)的基因序列，采用靶向katG 基因和inhA 基因啟動(dòng)子區(qū)域的探針檢測(cè)INH 耐藥相關(guān)的基因序列。相關(guān)的meta分析顯示, 對(duì)于痰涂片抗酸染色陽(yáng)性的結(jié)核病患者，LPAs 檢測(cè)RIF 耐藥的敏感性和特異性分別為96.7%和98.8%，檢測(cè)INH 耐藥的敏感性和特異性分別為 90.2%和 99.2%[33]。然而，由于 LPAs 對(duì)涂陰結(jié)核病患者檢測(cè)的敏感性較差，WHO 僅推薦將LPAs 用于經(jīng)細(xì)菌學(xué)方法確診的患者的耐藥性分析。隨著Xpert MTB/RIF 技術(shù)和其它NAATs 技術(shù)的快速發(fā)展，目前已很少實(shí)驗(yàn)室采用LPAs 進(jìn)行結(jié)核病的診斷和一線抗結(jié)核藥物的耐藥性分析。然而，由于在檢測(cè)靶標(biāo)數(shù)量方面存在限制，NAATs 技術(shù)難以同時(shí)對(duì)一線和二線藥物進(jìn)行藥敏分析，因此新一代的LPAs 技術(shù)在對(duì)結(jié)核病二線藥物進(jìn)行藥敏分析方面獲得了較好的應(yīng)用，WHO 也因此再次對(duì)LPAs 在結(jié)核病藥敏分析中的應(yīng)用進(jìn)行了論證，并于2016 年推薦其用于對(duì)氟喹諾酮和結(jié)核病二線注射藥物，包括卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素等的藥敏分析[34]。然而，由于與二線藥物耐藥相關(guān)的基因數(shù)較多,耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)更多且較分散，即使是LPAs 系統(tǒng)也難以覆蓋所有的耐藥相關(guān)位點(diǎn)，因此對(duì)于LPAs 進(jìn)行二線藥物藥敏分析的性能，不同系統(tǒng)和不同實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)存在較大差異，因而WHO 也將LPAs 的推薦應(yīng)用范圍局限在廣泛耐藥患者的篩查中， 即僅用于確診的耐多藥結(jié)核或耐RIF 患者的二線藥物的耐藥性分析。盡管如此，由于可同時(shí)檢測(cè)的靶點(diǎn)多、檢測(cè)效率高且檢測(cè)成本較低,基于核酸分子雜交的結(jié)核病診斷和耐藥檢測(cè)技術(shù)仍獲得了較多研究者和臨床實(shí)驗(yàn)室的青睞, 如基于PCR 擴(kuò)增和核酸雜交芯片的TruenMTB/MTB-Rif Dx 系統(tǒng)和 GeneChipMDR 系統(tǒng)就分別在印度和中國(guó)獲批了臨床應(yīng)用， 并分別獲得了WHO 和比爾及梅琳達(dá)·蓋茨基金會(huì)結(jié)核病項(xiàng)目的技術(shù)驗(yàn)證和推廣[1,35-36]。

LPAs 一個(gè)比較突出的缺點(diǎn)是需要在PCR 擴(kuò)增后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測(cè),操作復(fù)雜且存在一定的生物安全和較高的實(shí)驗(yàn)室污染風(fēng)除,操作時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng),因而在很大程度上限制了這一技術(shù)的應(yīng)用和推廣。近年來(lái)，隨著微流控技術(shù)的發(fā)展和不斷成熟,很多研究者嘗試將微流控系統(tǒng)與核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合建立一種全自動(dòng)的核酸分子檢測(cè)系統(tǒng)，以期克服分子雜交操作復(fù)雜、生物風(fēng)險(xiǎn)和實(shí)驗(yàn)室污染較大的不足,并取得了較好的成果，如基于此原理的TruArray MDR-TB 系統(tǒng)就是通過(guò)微流控系統(tǒng)將PCR 擴(kuò)增、 核酸分子雜交和雜交產(chǎn)物檢測(cè)的各過(guò)程整合進(jìn)一個(gè)平臺(tái),從而實(shí)現(xiàn)結(jié)核病診斷和藥敏分析的自動(dòng)化檢測(cè)。這一平臺(tái)以IS6110 and IS1245 基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合群的檢測(cè),同時(shí)以分別靶向野生型和突變型 rpoB、katG、inhA、embB 和 rpsL 基因的寡核苷酸探針同時(shí)進(jìn)行雜交,實(shí)現(xiàn)同時(shí)完成Mtb 檢測(cè)、 一線和二線抗結(jié)核藥的耐藥基因型檢測(cè)的目的。研究結(jié)果顯示,其對(duì)一線抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測(cè)具有很好的準(zhǔn)確性, 其中對(duì)INH、RIF 和乙胺丁醇 （EMB） 耐藥的檢測(cè)敏感性分別為90.0%、100%和70%, 特異性分別為98.2%、95.0%和98.6%。由于設(shè)計(jì)的探針未能完全覆蓋鏈霉素（streptomycin, SM）耐藥的相關(guān)基因，這一系統(tǒng)對(duì)二線藥物SM 耐藥的檢測(cè)敏感性較差，只有34.8%，但特異性達(dá)到99.2%，與耐藥表型的總體一致率也達(dá)到了89.5%[37]。其它一些基于微流控和核酸分子雜交技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)也在陸續(xù)地研究開(kāi)發(fā)當(dāng)中，如Veredus 公司推出的VereMTBTM 系統(tǒng)等， 但目前尚未納入WHO 的驗(yàn)證范圍。

3 基于基因測(cè)序的結(jié)核病診斷及藥敏分析技術(shù)

與NAATs 和核酸分子雜交等靶向性的基因檢測(cè)和分析技術(shù)不同,基因測(cè)序可提供完整和準(zhǔn)確的基因組或特定基因的序列信息,因此也被認(rèn)為是基因檢測(cè)和分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)測(cè)序原理的不同,目前的基因測(cè)序技術(shù)主要分為一代測(cè)序和二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）。一代測(cè)序技術(shù)的測(cè)序準(zhǔn)確率和通量更高, 但測(cè)序速度慢，檢測(cè)敏感性差，尤其是對(duì)突變分子檢出的分辨率不佳（一般只能檢測(cè)20%以上的突變分子）,因而在結(jié)核病診斷和藥敏分析中的應(yīng)用價(jià)值不是很好,目前往往被用作二代測(cè)序結(jié)果的進(jìn)一步確認(rèn)。NGS又被稱(chēng)為大量并行測(cè)序或高通量測(cè)序,具有測(cè)序速度快、檢測(cè)效率高、敏感性好和突變基因檢出分辨率高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷、腫瘤和遺傳性疾病的診斷等領(lǐng)域,在感染性疾病的診斷和藥敏分析領(lǐng)域也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用價(jià)值[38]。根據(jù)測(cè)序策略的不同，NGS 又可應(yīng)用于特定微生物種群的全基因組測(cè)序 （whole genome sequencing，WGS）和非靶向性的宏基因組測(cè)序（Metagenomic next-generation sequencing，mNGS）。

研究顯示,在Mtb 檢測(cè)方面，WGS 具有與NAA Ts 相似甚至更好的敏感性和特異性， 但在耐藥基因型的檢測(cè)方面明顯優(yōu)于NAATs 技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)[39,40]。一方面，由于可準(zhǔn)確檢測(cè)Mtb 的全基因組信息，WGS 可以覆蓋所有與Mtb 耐藥相關(guān)的基因和位點(diǎn)，因此對(duì)耐藥基因型的檢測(cè)更為靈敏。另一方面,由于可以獲得基因詳細(xì)的序列信息,NGS可避免在NAATs 和核酸分子雜交檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的因基因多態(tài)性導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果,因此具有更好的特異性, 可用于NAATs 技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的確認(rèn)[41]。此外，有研究顯示，NGS 可從敏感性Mtb 中檢出低至3%的耐藥Mtb, 因而具有比NAATs 和核酸分子雜交技術(shù)更優(yōu)的Mtb 異質(zhì)性耐藥的檢出率[42]。

然而截至目前，WGS 尚未作為常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于臨床結(jié)核病的診斷和藥敏分析,主要的原因除了成本較高外, 還在于WGS 檢測(cè)一般需在獲得Mtb純培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上進(jìn)行,因而極大地限制了這一技術(shù)的臨床應(yīng)用。近年來(lái), 為了克服WGS 的這一不足,有些研究者嘗試通過(guò)對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行快速預(yù)處理后再進(jìn)行WGS 檢測(cè)，如以快速液體培養(yǎng)陽(yáng)性的培養(yǎng)物進(jìn)行直接WGS 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以1ml 陽(yáng)性的快速液體培養(yǎng)物直接進(jìn)行核酸提取再進(jìn)行WGS檢測(cè),可從所有陽(yáng)性標(biāo)本中獲得高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果[43,44]。此外，有研究報(bào)道通過(guò)采用DNA 濃縮試劑盒對(duì)臨床痰標(biāo)本中提取的DNA 標(biāo)本進(jìn)行富集后再進(jìn)行WGS 檢測(cè),或以靶向結(jié)核分枝桿菌DNA 的生物素化的RNA 對(duì)標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌DNA 進(jìn)行特異性捕獲后再行WGS 檢測(cè)均能取得較好的檢測(cè)結(jié)果, 對(duì)于痰涂片抗酸陽(yáng)性的痰標(biāo)本，74%-83%的標(biāo)本可獲得測(cè)序結(jié)果[44,45]。這些研究提示通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)流程應(yīng)用WGS 進(jìn)行臨床標(biāo)本的直接檢測(cè)是可行的,但這一結(jié)論還需要更多臨床研究的支持。

與WGS 不同，mNGS 不針對(duì)特定的病原體進(jìn)行靶向測(cè)序,而是對(duì)標(biāo)本中所有微生物的基因組進(jìn)行高通量測(cè)序,再通過(guò)將測(cè)序獲得的讀數(shù)結(jié)果與微生物基因組文庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì),從而獲取標(biāo)本中微生物存在的信息,常用于臨床復(fù)雜感染的病原體檢測(cè)。近年來(lái)，mNGS 在Mtb 檢測(cè)，尤其是在肺外結(jié)核檢測(cè)中的性能也逐漸受到研究者的關(guān)注。一項(xiàng)對(duì)腦脊液標(biāo)本進(jìn)行的平行檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，mNGS診斷結(jié)核性腦炎的敏感性為66.67%,特異性為100%，顯著優(yōu)于抗酸染色法、培養(yǎng)法和PCR 法[46]。對(duì)結(jié)核病疑似患者的臨床標(biāo)本（包括痰標(biāo)本、腦脊液和腫液等）采用mNGS、Xpert 和Mtb 培養(yǎng)法進(jìn)行的平行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mNGS 診斷結(jié)核病 （包括肺結(jié)核和肺外結(jié)核） 的敏感性和特異性與Xpert 系統(tǒng)相當(dāng)，顯著優(yōu)于培養(yǎng)法[47,48]。鑒于mNGS 可同時(shí)發(fā)現(xiàn)多種可能的病原體，mNGS 在檢測(cè)病原體感染方面與靶向性的分子診斷比較有顯著的優(yōu)勢(shì),但mNGS 檢測(cè)病原體的性能受測(cè)序深度影響,不同的測(cè)序深度可能導(dǎo)致同一份標(biāo)本產(chǎn)生不同的檢測(cè)結(jié)果，此外，高昂的檢測(cè)費(fèi)用在很大程度上限制了這一技術(shù)的推廣應(yīng)用[49]。

目前，已有多個(gè)國(guó)家和地區(qū)在使用WGS 技術(shù)進(jìn)行耐藥結(jié)核病的篩查[50]，部分結(jié)核病低發(fā)的國(guó)家和地區(qū)已批準(zhǔn)采用WGS 技術(shù)進(jìn)行一線抗結(jié)核病藥物的耐藥性檢測(cè)[51]。鑒于NGS 技術(shù)良好的應(yīng)用前景，WHO 于 2018 年發(fā)布了 NGS 在 Mtb 耐藥性突變檢測(cè)中的技術(shù)指南[52]，同時(shí)為了進(jìn)一步規(guī)范對(duì)NGS 在結(jié)核病耐藥檢測(cè)中的結(jié)果解讀，由梅琳達(dá)·蓋茨基金會(huì)、關(guān)鍵路徑研究所（C-Path），創(chuàng)新型新診斷基金會(huì)（FIND）和WHO 在內(nèi)的多個(gè)機(jī)構(gòu)共同倡議建立的關(guān)聯(lián)測(cè)序結(jié)核病數(shù)據(jù)平臺(tái)ReSeqTB 也開(kāi)始支持高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)分析，并已經(jīng)被WHO所采納[53]。綜上，NGS 是一種非常有效的結(jié)核病診斷和藥敏分析的技術(shù)平臺(tái)， 但目前高昂的成本不太可能使其在短期內(nèi)成為結(jié)核病診斷和藥敏分析的常規(guī)方法。

4 基于宿主應(yīng)答靶標(biāo)和Mtb 循環(huán)游離DNA 檢測(cè)的結(jié)核病分子診斷技術(shù)

結(jié)核病分子和病原學(xué)診斷的主要標(biāo)本是痰,然而在某些情況下患者的痰標(biāo)本并不容易獲取，如無(wú)痰或少痰的患者、年老體弱的患者或兒童，在這些情況下結(jié)核病的診斷往往難以進(jìn)行,因此,WHO2 014 年提出應(yīng)重視開(kāi)發(fā)基于非痰標(biāo)本的結(jié)核病診斷技術(shù)[54],在此背景下基于宿主反應(yīng)和Mtb 游離D NA 檢測(cè)的結(jié)核病診斷方法受到大量研究者的關(guān)注。

基于宿主應(yīng)答的結(jié)核病分子診斷的靶標(biāo)主要包括兩類(lèi),免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本(mRNA)和非編碼RN A 的檢測(cè)。已有的研究顯示，基于宿主應(yīng)答靶標(biāo)的分子診斷方法在結(jié)核病診斷中的整體準(zhǔn)確性并不是很理想,但在區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和Mtb 的潛伏感染方面, 以及結(jié)核病預(yù)后評(píng)估方面有一定的價(jià)值[55-57]。

基于Mtb 游離DNA 檢測(cè)的方法被證實(shí)是非痰標(biāo)本診斷結(jié)核病, 尤其是肺外結(jié)核病的有效方法。如有研究顯示，采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)確診和疑診腹部結(jié)核患者腹水標(biāo)本中的Mtb 游離DNA 時(shí),其敏感性和特異性為70.9%和97.1%,顯著優(yōu)于Xpert 技術(shù)[58]。然而，來(lái)自不同課題組的臨床研究顯示，以血液和體液中Mtb 游離DNA 為靶標(biāo)的分子診斷技術(shù)對(duì)結(jié)核病的診斷敏感性從29%到79%不等，這些差異可能與采用的標(biāo)本、核酸提取的方式和檢測(cè)的靶基因不同有關(guān),提示以Mtb 游離DNA 為靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)核病的診斷并不穩(wěn)定, 進(jìn)一步對(duì)標(biāo)本采集、核酸提取和檢測(cè)的靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化可能有助于提高M(jìn)tb 游離DNA 檢測(cè)在結(jié)核病診斷中的價(jià)值[59]，采用更為靈敏的檢測(cè)技術(shù)，如dPCR和NGS 技術(shù)對(duì)循環(huán)Mtb 游離DNA 進(jìn)行檢測(cè)也是提高其檢測(cè)性能的有效方法[29]。

5 挑戰(zhàn)與希望

隨著分子診斷技術(shù)的快速發(fā)展,近年來(lái)結(jié)核病的病原學(xué)確診率逐年提高,接受耐藥性檢測(cè)患者的比例也有了顯著提升。WHO 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2019年約有57%的肺結(jié)核患者獲得了病原學(xué)確診，在獲得病原學(xué)確診的患者中有61%接受了耐藥性檢測(cè),這一數(shù)據(jù)在 2017 年為 51%，2012 年僅為 7%[1]。然而，盡管取得了較大的進(jìn)展，結(jié)核病的診斷仍面臨巨大的挑戰(zhàn),漏診和診斷延遲仍是阻礙結(jié)核病疫情防控的主要原因之一,尤其是在中低收入的國(guó)家和地區(qū)。WHO 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年仍有約300 萬(wàn)結(jié)核病患者未能獲得診斷或未進(jìn)行登記，在2019 年新發(fā)的耐多藥結(jié)核患者中, 僅有約38%接受了適當(dāng)?shù)闹委焄1]。

因此,大量涌現(xiàn)的高敏感性和高特異性的分子診斷技術(shù)并未從根本上改變結(jié)核病診斷的困境，其背后主要的原因在于這些新技術(shù)并未能得到很好的推廣應(yīng)用。有調(diào)查發(fā)現(xiàn),在17 個(gè)主要的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中,痰涂片抗酸染色仍是目前結(jié)核病診斷的最主要方法，而WHO 在十年前就開(kāi)始推薦的Xpert 檢測(cè)系統(tǒng)并未獲得廣泛的應(yīng)用[60]。因此，從目前的現(xiàn)狀來(lái)看單純發(fā)展新的結(jié)核病診斷技術(shù)并不足以改變結(jié)核病防控面臨的問(wèn)題,推廣這些技術(shù)可能更為重要。然而，高昂的檢測(cè)成本又使得這些技術(shù)難以在短期內(nèi)在中低收入國(guó)家和地區(qū)廣泛推廣,但世界上絕大部分的結(jié)核病患者恰恰分布在經(jīng)濟(jì)條件較差的中低收入國(guó)家,因此在全面衡量技術(shù)性能、 生物安全和經(jīng)濟(jì)可承受性的基礎(chǔ)上發(fā)展適合中低收入國(guó)家實(shí)際情況的分子診斷技術(shù),而非一味地追求兼具高敏感、全自動(dòng)和更低生物風(fēng)險(xiǎn)的技術(shù)可能才是最有效的策略。在這一方面，印度研發(fā)的TruenatMTB/TruenatMTB-Rif Dx 檢測(cè)系統(tǒng)是一個(gè)值得借鑒的經(jīng)驗(yàn)。該系統(tǒng)雖然在操作簡(jiǎn)便性和生物安全風(fēng)險(xiǎn)防控方面不如Xpert 系統(tǒng)，但技術(shù)性能和檢測(cè)時(shí)間與Xpert 系統(tǒng)相當(dāng)，成本卻遠(yuǎn)低于Xpert 系統(tǒng)。目前，TruenatMTB/TruenatMTBRif Dx 系統(tǒng)已經(jīng)在印度得到了較廣泛的推廣，用以替代價(jià)格昂貴的Xpert 系統(tǒng)[61]。最近，該檢測(cè)系統(tǒng)的技術(shù)性能也已經(jīng)過(guò)WHO 專(zhuān)家組的論證并得到了 W HO 的推薦[1]。

另一個(gè)困擾結(jié)核病防控的問(wèn)題在于結(jié)核病大多發(fā)生在醫(yī)療條件較差的偏遠(yuǎn)地區(qū),這些地區(qū)的患者除了經(jīng)濟(jì)條件受限外,往往難以及時(shí)得到相應(yīng)的醫(yī)療服務(wù),尤其是對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高的分子診斷服務(wù)。因此除了進(jìn)一步推廣低檢測(cè)成本的高效診斷技術(shù)外, 進(jìn)一步發(fā)展適合偏遠(yuǎn)地區(qū)檢測(cè)需求的POCT 快速檢測(cè)系統(tǒng)也很有必要。目前，Xpert 系統(tǒng)和TruenatMTB/TruenatMTB-Rif Dx 系統(tǒng)都推出了相應(yīng)的POCT 檢測(cè)平臺(tái)，WHO 也在大力提倡開(kāi)發(fā)更為低廉、靈活的POCT 檢測(cè)系統(tǒng)用于偏遠(yuǎn)地區(qū)的結(jié)核病診斷[1]。因此，我們有理由相信在不久的將來(lái)，更加便捷、高效且適合中低收入國(guó)家推廣使用的結(jié)核病分子診斷技術(shù)將得到快速發(fā)展，為結(jié)核病患者的及時(shí)診治提供更好的服務(wù)， 同時(shí)為全球結(jié)核病疫情的防控發(fā)揮更加積極的作用。