師麗剛

（洛陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南洛陽 471000）

產(chǎn)毒素大腸桿菌（ETEC）是引起斷奶仔豬腹瀉的重要因素之一，斷奶仔豬腹瀉后，可導(dǎo)致采食量和生長性能的下降，嚴(yán)重者可導(dǎo)致仔豬死亡，是危害斷奶仔豬的主要疾病之一，在仔豬養(yǎng)殖過程中應(yīng)該引起重視 （姜軒，2018）。臨床中仔豬的ETEC主要通過抗生素進(jìn)行防治，大量不合理地使用抗生素，不僅導(dǎo)致耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)和藥物殘留，還致使豬的免疫力下降，同時(shí)威脅著人類的健康（楊宇，2015）。復(fù)合益生菌制劑主要是由多種益生菌通過特殊工藝加工制成的一類活菌制劑，臨床中常見的益生菌主要有酵母菌類、乳酸菌類、腸球菌類、芽孢桿菌類等（孟祥宇，2019；胡興義，2018）。益生菌制劑具有促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育、調(diào)整腸道內(nèi)菌群平衡、提高免疫機(jī)能等作用，且不易產(chǎn)生耐藥性，被廣泛應(yīng)用（劉政，2017）。本試驗(yàn)以28日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬為研究對(duì)象，探討不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC后的斷奶仔豬生長性能、免疫機(jī)能及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。為進(jìn)一步的復(fù)合益生菌制劑在臨床中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 復(fù)合益生菌制劑主要由乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸糞球菌、酵母菌等組成，其中乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸糞球菌的活菌數(shù)均為≥9.0×109cfu/g，酵母菌活菌數(shù)≥4.5×109cfu/g，由洛陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室研發(fā)；ETEC血清型為O 149∶K 91，K88 ac購于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心（CVCC）；大腸桿鑒別麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、乳酸桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基（LBS）、雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基（BL）均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞因子（IL-2、IL-6）ELISA Kit試劑盒、免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）ELISA Kit試劑盒均購自上海允麥生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理 采用單因素隨機(jī)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選擇體重相近[（10.0±0.5） kg]的 28 日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬60頭，隨機(jī)分成4組，每組15個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，試驗(yàn)1組為對(duì)照組，試驗(yàn)2組為大腸桿菌感染組，試驗(yàn)3、4組分別在日糧中添加1.0、1.5 g/kg的復(fù)合益生菌制劑，試驗(yàn)開始 7 d，試驗(yàn) 2、3、4組灌服 ETEC 10 mL（109cfu/mL），試驗(yàn)1組給予等量的生理鹽水，試驗(yàn)期為14 d。每個(gè)重復(fù)組單獨(dú)代謝籠飼養(yǎng)，單獨(dú)給料，自由采食與飲水。按照常規(guī)飼養(yǎng)管理方法進(jìn)行飼養(yǎng)與管理，定期免疫、驅(qū)蟲。根據(jù) NRC（2012）斷奶仔豬營養(yǎng)需求設(shè)計(jì)配制日糧，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生長性能測(cè)定 試驗(yàn)期間對(duì)每個(gè)重復(fù)組仔豬單獨(dú)空腹稱重，記錄其初始體重、期末體重及試驗(yàn)期的耗料量及腹瀉情況，并計(jì)算平均日增重、平均日采食量、料重比及腹瀉率等生產(chǎn)性能指標(biāo)。

1.3.2 免疫指標(biāo)測(cè)定 在試驗(yàn)結(jié)束（14 d），每個(gè)組隨機(jī)抽取5頭試驗(yàn)斷奶仔豬，用一次性靜脈采血針和促凝真空采血管在前腔靜脈采血，離心分離血清，按照說明書檢測(cè)血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）和細(xì)胞因子（IL-2、IL-6）含量。

1.3.3 腸道微生物菌群測(cè)定 參照李平 （2019）報(bào)道方法，試驗(yàn)結(jié)束前3 d，每個(gè)試驗(yàn)組采集仔豬新鮮糞便大約100 g，經(jīng)過處理后分別于乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、沙門菌鑒別培養(yǎng)基上進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄每克糞便中菌群總數(shù)，用對(duì)數(shù)（lg cfu/g）表示。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較及方差分析，以P＜0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC斷奶仔豬生長性能的影響 由表2可知，試驗(yàn)3、4組平均日增重較2組分別提高3.9%、6.4%，差異性顯著（P＜0.05），試驗(yàn)2組低于1組，差異性顯著（P＜0.05），試驗(yàn)3、4組之間相比差異性不顯著 （P＞0.05）；試驗(yàn)3、4組平均采食量均高于2組，差異性不顯著（P＞0.05），試驗(yàn)1組均高于試驗(yàn) 2、3、4 組，差異性顯著（P ＜ 0.05）；試驗(yàn) 3、4 組料重比較2組分別降低4.7%、7.6%，差異性顯著（P＜0.05），試驗(yàn)2組高于1組，差異性顯著（P＜0.05），試驗(yàn)3、4組之間相比差異性不顯著 （P＞0.05）；試驗(yàn) 3、4組腹瀉率較 2組分別降低31.2%、33.3%，差異性顯著（P ＜ 0.05），試驗(yàn) 2組高于 1組，差異性顯著（P ＜ 0.05），試驗(yàn) 3、4組之間相比差異性不顯著（P＞0.05）。

表2 不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC斷奶仔豬生長性能測(cè)定結(jié)果

2.2 不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC斷奶仔豬免疫指標(biāo)的影響 由表3可知，試驗(yàn)3、4組血清中 IgG、IgA、Il-2含量（P ＜ 0.05）較 2組相比分別提高 14.8%、18.1%、10.7%、14.3%、8.0%、8.6%；試驗(yàn)1組高于2組，差異性顯著（P＜0.05），試驗(yàn) 1、3、4 組之間相比，差異性不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)3、4組血清中的IgM、IL-6含量均高于2組，但差異性不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)1組顯著高于試驗(yàn) 2、3、4 組（P ＜ 0.05），試驗(yàn) 2、3、4 組之間相比差異性不顯著（P＞0.05）。

表3 不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC斷奶仔豬免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果ng/mL

2.3 不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC斷奶仔豬腸道菌群的影響 由表4可知，試驗(yàn)3、4組糞便中大腸桿菌的含量（P＜0.05）較2組相比分別降低19.1%、19.7%；試驗(yàn)1組顯著低于2組（P ＜ 0.05），試驗(yàn) 1、3、4 組之間均差異不顯著（P ＞0.05）；試驗(yàn)3、4組糞便中的沙門菌含量均低于2組，但差異性不顯著（P＞0.05），試驗(yàn)1組糞便中的沙門菌含量顯著低于試驗(yàn) 2、3、4組 （P ＜ 0.05）；試驗(yàn)3、4組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌的含量 （P＜0.05）較2組相比分別提高20.4%、23.1%、6.7%、7.8%；試驗(yàn) 1組顯著高于2組（P＜0.05），試驗(yàn) 1、3、4組之間相比差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC斷奶仔豬腸道菌群測(cè)定結(jié)果lg cfu/g

3 討論

3.1 不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC斷奶仔豬生長性能的影響 相關(guān)研究表明復(fù)合益生菌制劑含有多種活性物質(zhì)，可以提高畜禽的生長性能及生產(chǎn)性能，被廣泛應(yīng)用于畜禽的養(yǎng)殖中（易曉菲，2016）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)3、4組平均日增重均顯著高于2組（P＜0.05），試驗(yàn) 3、4組平均采食量均高于2組（P＞0.05），試驗(yàn)3、4組料重比均顯著低于2組（P＜0.05），說明不同水平的復(fù)合益生菌制劑可以提高感染ETEC斷奶仔豬平均日增重，降低料肉比，因而提高其生長性能。可能由于復(fù)合益生菌制劑所含的活性物質(zhì)可以抑制或者緩解ETEC在斷奶仔豬腸道內(nèi)定植，減少ETEC對(duì)仔豬腸道的損傷，同時(shí)還可以提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而提高斷奶仔豬的生長性能。這一結(jié)論與任繼平（2015）等研究結(jié)果芽孢桿菌可以提高大腸桿菌感染斷奶仔豬生長性能基本上一致。

3.2 不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC斷奶仔豬免疫指標(biāo)的影響 免疫球蛋白在介導(dǎo)體液免疫過程中起重要的作用，是評(píng)價(jià)免疫機(jī)能的重要指標(biāo)（張召興，2017）。免疫球蛋白主要包括IgG、IgM、IgA，IgG主要介導(dǎo)機(jī)體的抗感染免疫，IgM是體液機(jī)體免疫中出現(xiàn)最早的抗體，具有很強(qiáng)的殺菌功能，IgA主要參與黏膜免疫（隋明靜，2019）。 細(xì)胞因子IL-2可以調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞活性，促使抗體產(chǎn)生，是介導(dǎo)細(xì)胞免疫主要細(xì)胞因子之一，細(xì)胞因子IL-6可促進(jìn)B細(xì)胞分化、增殖和再次產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在免疫應(yīng)答中起著重要的作用，是免疫系統(tǒng)中重要的細(xì)胞因子（謝紅兵，2018）。本試驗(yàn)研究表明，試驗(yàn)3、4組血清中IgG、IgA、Il-2含量均顯著高于2組（P＜ 0.05），試驗(yàn) 3、4組血清中的 IgM、IL-6含量均高于2組（P＞0.05），說明不同水平的復(fù)合益生菌制劑可以提高感染ETEC斷奶仔豬血清中免疫球蛋白和細(xì)胞因子的含量，提高免疫機(jī)能。可能由于復(fù)合益生菌制劑所含的活性物質(zhì)可以激活感染ETEC斷奶仔豬免疫系統(tǒng)，有效調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力，尤其是黏膜免疫，能有效抵抗ETEC的感染，提高抗感染免疫。

3.3 不同水平的復(fù)合益生菌制劑對(duì)感染ETEC斷奶仔豬腸道菌群的影響 動(dòng)物腸道菌群中致病菌主要包含大腸桿菌、沙門菌等，當(dāng)外界條件改變時(shí)，大腸桿菌、沙門菌會(huì)破壞腸道菌群平衡，引起動(dòng)物一系列的疾?。钋甥悾?017）。因此，腸道中菌群結(jié)構(gòu)的平衡，對(duì)動(dòng)物健康具有重要意義。本試驗(yàn)研究表明，試驗(yàn)3、4組糞便中大腸桿菌的含量顯著低于2組（P＜0.05），試驗(yàn)3、4組糞便中的沙門菌含量均低于2組（P＞0.05），試驗(yàn)3、4組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌的含量顯著高于2組（P＜0.05）。說明不同水平的復(fù)合益生菌制劑可以抑制感染ETEC斷奶仔豬腸道內(nèi)大腸桿菌、沙門菌等有害病原菌的生長，提高其有益菌乳酸菌和雙歧桿菌等的生長，可以有效地修復(fù)感染ETEC斷奶仔豬腸道黏膜的損傷，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡?？赡苡捎趶?fù)合益生菌制劑通過改善宿主腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，有利于有益菌生長，同時(shí)有效抑制有害菌的生長，有效的調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。