陳錫龍，錢莘莘，孫真崢，王培峰，焦貴懷，郭 萍，周藝林，趙 貴

（貴州省獸藥飼料檢測所，貴陽550003）

白英（Solanum lyratumThunb）為茄科植物白英的全草，俗稱白毛藤，性微寒，味苦，具有清熱解毒，袪風(fēng)除濕等功效［1］，用于治療感冒發(fā)熱、黃疸型肝炎、腎炎水腫、子宮頸糜爛、癌癥等疾病。 尤其對肺癌、胃癌、肝癌、宮頸癌等多種癌癥具有很好的療效［2］。 化學(xué)及現(xiàn)代藥理研究表明［3］，白英主要含皂苷類、甾體類化合物、有機(jī)酸、黃酮類等，是白英藥理作用的主要有效成分。 近年來，有關(guān)白英的研究主要集中在其抗腫瘤機(jī)制方面，如生物堿對人宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖的抑制作用［4］、抑制人神經(jīng)瘤母細(xì)胞系SH－SY5Y 細(xì)胞氧化活性［5］、影響肝癌Huh－7 細(xì)胞p38 和Caspase－3 的表達(dá)［6］，白英提取物具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［7］等。 白英是臨床上應(yīng)用較廣泛的抗腫瘤中草藥，需求量大，但對白英質(zhì)量控制研究仍處于初步階段［8］。 齊偉等［9］建立了HPLC 法同時測定白英中綠原酸和咖啡酸的含量，林世和［10］等建立了HPLC 法同時測定白英葉中綠原酸、咖啡酸及蘆丁的含量，孫立新［11］等建立了HPLC 法測定中藥白英中薯蕷皂苷元的含量，為白英質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立做了一些基礎(chǔ)性工作。 白英未收載入現(xiàn)行《中國藥典》中，雖收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017 版中藥卷）［12］中，主治外感風(fēng)寒，濕熱黃疸，水腫，帯下；外治癰瘡腫毒。 但項下僅有性狀及鑒別，已經(jīng)不能滿足越來越多的臨床應(yīng)用及質(zhì)量控制需要。 本研究對上述文獻(xiàn)中測量白英新鮮藥材和飲片中綠原酸、咖啡酸的HPLC 法進(jìn)行了驗(yàn)證及比較，發(fā)現(xiàn)白英新鮮藥材和飲片中綠原酸的含量變化太大，不宜作為控制白英的質(zhì)量指標(biāo)；同時，借鑒了相關(guān)白英質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的薄層色譜鑒別方法等，較全面地建立了白英顯微、薄層鑒別，水分、灰分檢查，醇溶性浸出物以及藥材中咖啡酸含量測定方法，以期為白英的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1．1 儀器 Agilent infinity LC1260 高效液相色譜儀（配紫外檢測器）；BP211D 型電子分析天平（德國塞多利斯公司）。

1．2 試藥 綠原酸對照品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：Z0261702，含量：98．3%；咖啡酸對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號：110885 －200102，含量：100%；薯蕷皂苷元對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號：111539 －200001。 共收集到白英原生藥材及飲片15 批。 其中自行采集到原生藥6 批（所采集的藥材除少部分制成標(biāo)本供鑒別用外，其余部分均干燥粉碎后置磨口玻璃瓶中保存），5 批采自貴州省安順市平壩縣，1 批采自浙江省金華市，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室魏升華教授鑒定均為白英。 9 批飲片分別購于北京市、廣西玉林、貴陽市的藥材公司，詳情見表1。 甲醇為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

表1 白英來源登記表Tab 1 Registration information of 15Solanum LyratumThunb． samples

2 方法與結(jié)果

2．1 性狀 本品長1 ～4 cm，全株被毛，幼枝及葉上尤多。 根較細(xì)，稍彎曲，淺棕黃色。 莖圓柱形，稍有棱，灰綠色或灰黃色。 葉互生，葉片皺縮，易碎，完整者展平后呈長卵形，長3 ～8 cm，寬1 ～3． 5 cm；先端漸尖，基部心形，全緣或下部2 淺裂至中裂，裂片耳狀或戟狀；上表面棕綠色，下表面綠灰色；葉柄長2 ～4 cm。 聚傘花序與葉互生，花序梗折曲狀，花冠5 裂，長約5 mm，棕黃色。 漿果球形，直徑約1．2 cm，綠棕色至紅黑色，果皮薄，稍有光澤。種子扁圓形，直徑1．5 mm，氣微，味淡。

2．2 鑒別

2．2．1 顯微鑒別 本品粉末灰綠色。 石細(xì)胞淡黃色，類圓形、類方形、長條形，直徑18 ～35 μm，長45～130 μm，紋孔小，孔溝明顯。 纖維淡黃色或近無色，長梭形，末端斜尖。 葉表皮細(xì)胞壁波狀彎曲，內(nèi)含草酸鈣方晶及砂晶，氣孔不定式。 非腺毛單細(xì)胞，完整者長150 ～500 μm，直徑18 ～30 μm。

2．2．2 薄層鑒別 稱取本品粉末2．5 g，置250 mL具塞錐形瓶中，加入水13 mL，甲醇70 mL，再加入鹽酸17 mL，水浴加熱回流3 h，冷卻，過濾，取續(xù)濾液50 mL，用石油醚（60 ～90 ℃）萃取4 次，每次50 mL，分取石油醚層，回收石油醚層至干，加3 mL甲醇溶解，濾過（0．45 μm），作為供試品溶液。 另取薯蕷皂苷元對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg的溶液作為對照品溶液。 照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)已烷－乙酸乙酯（2∶1）作為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。 供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖1）。

2．2．3 樣品檢測 用新建立的方法分別對編號為1 ～15 號白英新鮮藥材或飲片樣品行薄層色譜鑒別試驗(yàn)，結(jié)果如圖1。 結(jié)果表明：白英新鮮藥材或飲片色譜中，在與薯蕷皂苷元對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

圖1 白英及其飲片中薯蕷皂苷元的薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatograms of diosgenin in raw material and decoction pieces of Solanum Lyratum Thunb．

2．3 檢查

2．3．1 水分 照水分測定法（《中國獸藥典》2015年版二部附錄0832 第一法［13］）測定不同產(chǎn)地13批樣品的含水量分別為8．71%、7．12%、5．52%、4．60%、4．60%、4．90%、5． 44%、6． 11%、8． 92%、7．60%、3．44%、2．88%、2．94%。 平均值為5．6%，以120%計水分應(yīng)為7．0%，故規(guī)定水分不得過7．0%。

2．3．2 總灰分 照總灰分測定法（《中國獸藥典》2015 年版二部附錄2302［13］）測定不同產(chǎn)地13 批樣品的總灰分分別為9． 42%、9． 78%、5． 82%、6．87%、12．20%、6．22%、5．94%、4．84%、5．24%、8．54%、5．48%、7．58%、8．00%。 平均值為7．4%，以120%計水分應(yīng)為9．0%，故規(guī)定總灰分不得過9．0%。

2．4 醇溶性浸出物 照醇溶性浸出物測定法（《中國獸藥典》2015 年版二部附錄2201［13］）測定，13 批不同產(chǎn)地樣品的醇溶性浸出物分別為4． 64%、5．68%、9．29%、6．56%、7． 35%、4． 47%、3． 72%、3．66%、3．78%、5．78%、5．37%、4．72%、4．24%。平均值為5．3%，以80%計水分應(yīng)為4．0%。 故規(guī)定醇溶性浸出物不得少于4．0%。

2．5 綠原酸、咖啡酸含量測定

2．5．1 溶液的制備

2．5．1．1 對照品貯備溶液的制備 取綠原酸和咖啡酸對照品適量，精密稱定，分別用75%的乙醇溶液制成每1 mL 含1．0 mg 的溶液，即得。

2．5．1．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取上述對照品貯備溶液適量，逐級稀釋成每1 mL 含綠原酸5．0、20、50、200、1000 μg 和咖啡酸2．0、5．0、10．0、20．0、50．0 μg 的混合對照品溶液系列，精密吸取各對照品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以綠原酸和咖啡酸色譜峰面積為縱坐標(biāo)，其相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．5．1．3 供試品溶液的制備 取本品粉末約1．0 g，置250 mL 具塞三角瓶中，精密加入75%乙醇溶液10 mL，混勻，密塞，超聲處理30 min，取出，放冷。過0．45 μm 濾膜，濾液作為供試品溶液。

2．5．2 測定方法

2．5．2．1 色譜條件 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0．4%磷酸溶液－乙腈（87∶13）為流動相；檢測波長為327 nm。 在此色譜條件下，綠原酸、咖啡酸對照品混合溶液及供試品溶液高效液相色譜圖見圖2。

圖2 綠原酸和咖啡酸混合對照品溶液及供試品溶液高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatorams of chlorogenic acid and caffeic acid in referance substance andSolanum LyratumThunb． sample

2．5．2．2 線性及范圍 分別精密稱取綠原酸及咖啡酸對照品約10 mg（實(shí)際稱量10．17、9．99 mg），各置于一10 mL 量瓶中，加75%的乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，得含綠原酸和咖啡酸對照品濃度均為1．0 mg／mL 的對照品貯備溶液，用該兩個對照品貯備溶液配制成含綠原酸濃度為5． 0、20、50、200、1000 μg／mL，咖啡酸濃度為2．0、5．0、10、20、50 μg／mL的混合對照品溶液系列，精密吸取各對照品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。 分別以綠原酸或咖啡酸色譜峰面積（Area）， 對其相應(yīng)濃度（Amt， μg／mL）進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程，可知綠原酸在5． 0 ～1000 μg／mL、咖啡酸在2． 0 ～50 μg／mL內(nèi)線性關(guān)系良好。 相關(guān)數(shù)據(jù)分別見表2。

表2 線性方程和相關(guān)系數(shù)Tab 2 Linear equation and related coefficient

2．5．2．3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定綠原酸、咖啡酸峰面積，計算6 次進(jìn)樣峰面積的RSD分別為1．2%和0．2%，表明，方法精密度良好。

2．5．2．4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、6、12、24 h 內(nèi)測定綠原酸、咖啡酸的峰面積，并計算峰面積的RSD分別為1．43%和1．16%，結(jié)果表明，在24 h 內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

2．5．2．5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批白英粉末共5 份，按樣品溶液的制備方法制成供試品溶液，依法測定綠原酸、咖啡酸峰面積并計算RSD分別為1．12%和0．76%，表明方法重復(fù)性良好。

2．5．3 綠原酸和咖啡酸添加回收試驗(yàn) 分別向12號樣品（綠原酸和咖啡酸的含量分別為1．5 mg／mL和50 μg／mL）中添加綠原酸對照品濃度為10．17 mg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液150 μL 和咖啡酸對照品濃度為1．0 mg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液55 μL，充分混勻后依法測定綠原酸和咖啡酸的含量并計算回收率，一共作8個平行，結(jié)果見表3，結(jié)果表明：8 個平行樣品綠原酸和咖啡酸的平均添加回收率分別為86． 5% 和83．0%。

表3 綠原酸和咖啡酸添加回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Recovery results of chlorogenic acid and caffeic acid

2．5．4 樣品含量的測定 按2．5 項測定法對編號為1 ～13 的白英樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表4。所測13 批樣品中綠原酸的平均含量為4．59 mg／g，而咖啡酸含量的平均值為76．90 μg／g。 3 號樣品中綠原酸和咖啡酸含量（21． 80 mg／g 和294． 90 μg／g）明顯偏高，分析認(rèn)為主要原因是該批樣品在采集時均為當(dāng)年新長成的較幼嫩的植株，其較高的含量并不具代表性，作為離群值舍去。 其余12 批樣品中綠原酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為100．6%，而12 批樣品中咖啡酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差則為53．5%。 綠原酸和咖啡酸含量最高的5 號樣品分別是含量最低的8 號樣品的94 倍和7 倍，結(jié)果表明白英中咖啡酸含量雖然較低，但卻比綠原酸穩(wěn)定，變化幅度也較小，故采用咖啡酸的含量測定來控制白英的質(zhì)量。 去除離群值的12 批樣品中咖啡酸含量的平均值為58．73 μg／g，58．73 μg／g ×80%＝46．98 μg／g，因此，使用47．0 μg／g 作為咖啡酸的測量限值。

表4 13 批白英樣品中綠原酸和咖啡酸含量測定數(shù)據(jù)Tab 4 Detection results of chlorogenic acid and caffeic acid in 13Solanum LyratumThunb． samples

2．5．5 兩種溶劑處理樣品綠原酸和咖啡酸含量的測量結(jié)果 使用50%的甲醇溶液和75%的乙醇溶液分別處理2 批樣品，測定其中綠原酸和咖啡酸的含量，以考察兩種提取方法的優(yōu)劣。 結(jié)果見表5。結(jié)果表明：使用75%的乙醇溶液處理樣品比使用50%的甲醇溶液處理樣品，咖啡酸的收獲率均有非常明顯提高。

表5 不同溶劑處理2 批樣品的綠原酸及咖啡酸含量測定結(jié)果Tab 5 Detection results of chlorogenic acid and caffeic acid in 2Solanum LyratumThunb． Samples dealed with two different solvent

3 討論與結(jié)論

3．1 選擇薯蕷皂苷元作為薄層色譜鑒別對象的考慮 白英中含有較高的綠原酸及薯蕷皂苷元，兩者均可考慮作為薄層色譜鑒別的目標(biāo)物質(zhì)。 且《中國獸藥典》中對于綠原酸的薄層色譜鑒別有很成熟的方法，從這個角度而言，綠原酸的薄層色譜鑒別應(yīng)該作為優(yōu)先考慮的范疇。 但在對白英中的綠原酸進(jìn)行薄層色譜鑒別時發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)白英飲片的薄層色譜鑒別顯色均不明顯甚至不顯色，原因應(yīng)當(dāng)是綠原酸不穩(wěn)定，在貯藏過程中容易分解所致。 對白英中的薯蕷皂苷元進(jìn)行薄層色譜鑒別時，新鮮藥材和飲片的薄層色譜顯色均沒有出現(xiàn)明顯差異。

3．2 薯蕷皂苷元薄層色譜鑒別的顯色特點(diǎn) 對薯蕷皂苷元進(jìn)行薄層色譜鑒別時，斑點(diǎn)的顯色情況會因加熱及放置時間的不同而出現(xiàn)較大的差別，但基本上是在磚紅色到暗綠色之間變化，且對照品與樣品所顯斑點(diǎn)的顏色均保持一致，并非顯色方法不佳所致。

3．3 選擇咖啡酸而沒有選擇綠原酸作為含量測定控制指標(biāo)的考慮 研究中發(fā)現(xiàn)白英新鮮藥材和飲片中綠原酸的含量均比較高，13 批樣品的平均含量可達(dá)4．59 mg／g，而咖啡酸的含量則相對低得多，13 批樣品的平均含量僅為76．90 μg／g。 但不同批次的綠原酸含量存在巨大差距，而且綠原酸不穩(wěn)定，貯藏過程中容易發(fā)生降解；而不同批次的咖啡酸含量的偏差則相對小得多，故選擇咖啡酸而不選綠原酸作為控制白英質(zhì)量的含量指標(biāo)。

3．4 性狀中果實(shí)的顏色 研究中采集的新鮮藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室魏升華教授鑒定確定均為白英。 關(guān)于白英果實(shí)的顏色文獻(xiàn)中的描述存在一定差異，如《中國獸藥典》中果實(shí)的顏色為綠棕色，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003 版）［14］中為紅黑色，余南才［15］等認(rèn)為果實(shí)為淡黃色至暗紅色。 不同文獻(xiàn)中白英果實(shí)的顏色之所以存在差異，應(yīng)該與采集時間有關(guān)，采集時間太早，果實(shí)的顏色尚為綠色，故干燥后呈現(xiàn)為綠棕色或淡棕色；采集時間過晚，果實(shí)已經(jīng)完全成熟，顏色呈深紅色，干燥后會呈現(xiàn)出紅黑色的性狀；采集時間處于兩者之間時，果實(shí)正好由綠色變?yōu)榧t色，所以干燥后會呈現(xiàn)出淡黃色的情況。 所以，綜合考慮各種情況后，決定把果實(shí)的顏色修改為綠棕色至紅黑色。

3．5 薯蕷皂苷元含量的測定 本研究還建立了白英中薯蕷皂苷元含量的高效液相色譜測定方法及相應(yīng)的含量測定標(biāo)準(zhǔn)。

本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較全面、客觀地建立了白英性狀、顯微、薄層鑒別，水分、灰分檢查，醇溶性浸出物以及其中咖啡酸含量測定的方法。 方法專屬性強(qiáng)，靈敏度佳，準(zhǔn)確度高，具有很強(qiáng)的可操作性，為控制白英的質(zhì)量提供了較全面的科學(xué)依據(jù)，可作為控制白英的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。