羅蘭心，姜青，李翔，傅孝龍，張雅暄，滕杰，*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院，江西南昌330045；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)軟件學(xué)院，江西南昌330045；4.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)計算機與信息工程學(xué)院，江西南昌330045）

隨著我國茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟的迅速發(fā)展，茶葉加工及深加工的規(guī)模與日遞增，同時，茶產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生了大量廢棄物，如茶渣、茶梗、茶碎末等。其中，茶梗以烏龍茶中的鐵觀音茶最為常見[1]，茶梗中主要含有茶多酚[2]、茶多糖[3]、生物堿[4]、芳香類物質(zhì)[5]等活性成分，李楊等[6]測定鐵觀音茶梗中茶多酚含量為8.07%，茶多糖含量為1.10%，許雨石[7]測定鐵觀音茶梗中茶多酚含量為11.95%。目前，茶梗產(chǎn)量約占烏龍茶總量的20%，僅福建省安溪縣每年茶梗產(chǎn)量就高達50000 t[7]，只有少量茶梗制成茶枕或空氣吸附劑，造成資源的極大浪費[8]，若能對茶梗中的功能成分進行提取利用，既能提高茶葉的附加值，又能變廢為寶，對資源優(yōu)化和環(huán)境治理具有重要意義。

茶多酚（tea polyphenols，TP）又名茶單寧、茶鞣質(zhì)，是茶葉中所含有的一類多羥基酚類化合物的總稱，約占茶葉干重的18%～36%，在烏龍茶梗中含量為6%～13%。兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，約占到茶多酚總量的65%～80%[9]。茶多酚作為一種新型的天然抗氧化劑，具有殺菌和抑制細菌生長的作用，還可清除活性氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抗衰老、抗輻射等，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、日用化工等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[10-11]。

目前，提取茶多酚的常用方法包括有機溶劑法、生物酶法、超聲波輔助浸提法、微波輔助浸提法、沉淀法、超高壓法、超臨界萃取法[12-14]。其中，有機溶劑法存在試劑殘留、安全隱患問題，超濾法、超壓真空法、超臨界萃取、超聲波輔助浸提和微波輔助浸提所用的設(shè)備技術(shù)和經(jīng)濟成本高[15]，酶法最大優(yōu)勢是反應(yīng)條件溫和，茶多酚中有效成分兒茶素在提取過程中幾乎不損失，有效成分的提取量高；同時所得產(chǎn)物純度、穩(wěn)定性、活性均較高，且無污染。此外，酶法還具有縮短提取時間、降低能耗、降低生產(chǎn)成本等優(yōu)勢[16]。本試驗以烏龍茶梗中茶多酚提取量為考察指標，利用單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗研究生物酶法提取茶多酚的工藝條件，旨在為茶梗廢棄物的精深加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏龍茶茶梗：市售，2019年產(chǎn)自福建省安溪縣如意茶廠，茶梗粉碎后過40目篩。

果膠酶（≥1.1 U/mg）：美國Fluka公司；中性蛋白酶（≥50 000 U/g）：山東蘇柯漢生物工程股份有限公司；纖維素酶（≥15 000 U/g）、福林酚試劑（分析純）：國藥集團；沒食子酸標準品（＞98%，分析純）：上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；722N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SHZ-82A水浴恒溫振蕩器：金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SHB-III T循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FZ102植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 標準曲線制作及茶多酚含量測定

茶多酚含量測定參照國標GB/T 8318-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》的福林酚法[17]。稱取0.110 g沒食子酸于100 mL容量瓶中溶解并定容，搖勻后分別移取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的沒食子酸標準液于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容、搖勻。分別移取1.0 mL沒食子酸標準液，加入5.0 mL 10%福林酚試劑搖勻，靜置3 min～8 min，再加入4 mL 7.5%碳酸鈉溶液，25℃室溫靜置60 min，765 nm波長處測定吸光值。以蒸餾水代替沒食子酸標準液為空白組。以沒食子酸濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標制作標準曲線，標準曲線方程為：y=0.011 7x+0.019 1，R2=0.998 1，說明測定范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。吸取1.0 mL茶梗提取液于25 mL容量瓶中，移取上述1.0 mL供試液，按照標準曲線方程計算茶梗中茶多酚總含量及不同浸提條件下的茶多酚提取量。

1.4 單因素試驗

1.4.1 酶種類對茶梗茶多酚提取量的影響

準確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），酶解溫度50℃，反應(yīng)時間50 min參數(shù)下，分別考察酶添加量為1.0%（以底物質(zhì)量計）的5種酶體系[果膠酶（種類1），纖維素酶（種類2），果膠酶與纖維素酶合成復(fù)合酶（種類3），果膠酶，纖維素酶及蛋白酶合成復(fù)合酶（種類4），蛋白酶（種類5）]對茶多酚提取量的影響。

1.4.2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對茶梗茶多酚提取量的影響

準確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），復(fù)合酶添加量 1.0%（以底物質(zhì)量計），酶解溫度50℃，反應(yīng)時間50 min參數(shù)下，考察果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為 2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5對茶多酚提取量的影響。

1.4.3 復(fù)合酶添加量對茶梗茶多酚提取量的影響

準確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），酶解溫度50℃，反應(yīng)時間50 min參數(shù)下，分別考察0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3，質(zhì)量比）添加量對茶多酚提取量的影響。

1.4.4 料液比對茶梗茶多酚提取量的影響

準確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3，質(zhì)量比）添加量1.0%，酶解溫度50 ℃，反應(yīng)時間 50 min 參數(shù)下，考察1∶10、1∶15、1∶20、1 ∶25、1∶30（g/mL）的料液比對茶多酚提取量的影響。

1.4.5 酶解溫度對茶梗茶多酚提取量的影響

準確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2 ∶3，質(zhì)量比）添加量1.0%，反應(yīng)時間50 min參數(shù)下，考察酶解溫度30、40、50、60、70 ℃對茶多酚提取量的影響。

1.4.6 酶解時間對茶梗茶多酚提取量的影響

準確稱取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3，質(zhì)量比）添加量1.0%，酶解溫度50℃參數(shù)下，考察反應(yīng)時間30、40、50、60、70 min 對茶多酚提取量的影響。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

依照Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，基于單因素試驗結(jié)果進行三因素三水平試驗設(shè)計，選取復(fù)合酶添加量（A）、料液比（B）、酶解溫度（C）為響應(yīng)因子，使用Design-Expert 8.0軟件進行數(shù)據(jù)擬合優(yōu)化鐵觀音茶梗中茶多酚提取工藝。試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計試驗因素與水平Table 1 Variables and levels in response surface design

1.6 試驗數(shù)據(jù)分析

通過Excel 2007軟件處理相關(guān)試驗數(shù)據(jù)，并用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和顯著性分析，利用Design-expert 8.0軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗和分析回歸模型結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶種類的確定

不同酶種類對茶梗中茶多酚提取量的影響見圖1。

由圖1可知，5種酶體系獲得茶梗中茶多酚提取量差異顯著（P＜0.05），且復(fù)合酶的作用效果高于單一酶。提取量最低的是種類5（蛋白酶），僅有27.47 mg/g，種類3（果膠酶與纖維素酶）的茶多酚提取量最高，達到79.17 mg/g，其次是種類4（果膠酶、纖維素酶和蛋白酶），茶多酚提取量為67.76 mg/g，說明蛋白酶的存在會抑制果膠酶與纖維素酶的復(fù)合作用，種類1（果膠酶）和種類2（纖維素酶）的茶多酚提取量分別為35.62 mg/g和45.26 mg/g，因此，確定酶種類3（果膠酶與纖維素酶合成復(fù)合酶）作為提取鐵觀音茶梗中茶多酚的復(fù)合酶。

圖1 不同酶種類對茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.1 Effect of enzyme types on extraction of tea polyphenol in tea stalks

2.1.2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比的確定

不同果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對茶梗中茶多酚提取量的影響見圖2。

圖2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.2 Effect of pectinase-cellulose mass ratio on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖2可知，果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比在2∶1～2∶3范圍內(nèi)，隨著復(fù)合酶中纖維素酶的用量增加，茶多酚提取量逐漸提高，由62.77 mg/g提高到80.02 mg/g（P＜0.05），原因是提高纖維素酶用量能夠使細胞壁破裂更充分，促使茶多酚大量浸出。果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為2∶3時，兩種酶發(fā)揮最大活性，但隨著纖維素用量的繼續(xù)增加，茶多酚提取量呈下降趨勢，質(zhì)量比為2∶5時茶多酚提取量為70.56 mg/g，說明復(fù)合酶對底物濃度呈飽和狀態(tài)[18]。因此，確定復(fù)合酶中果膠酶和纖維素酶質(zhì)量比為2∶3適宜。

2.1.3 復(fù)合酶添加量的確定

不同復(fù)合酶添加量對茶梗中茶多酚提取量的影響見圖3。

圖3 復(fù)合酶添加量對茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.3 Effect of compound enzymatic addition on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖3可知，隨著果膠酶與纖維素酶組成的復(fù)合酶添加量的升高，茶多酚提取量顯著增加（P＜0.05），當復(fù)合酶添加量為1.0%時，提取量達到最大值75.31 mg/g，繼續(xù)增加復(fù)合酶添加量，茶多酚提取量呈現(xiàn)下降趨勢，其原因是復(fù)合酶添加量達到一定值時，與反應(yīng)底物達到飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加復(fù)合酶添加量會使酶解反應(yīng)受到抑制[19]。因此，確定復(fù)合酶添加量為1.0%最佳。

2.1.4 料液比對茶梗茶多酚提取量的影響

不同料液比對茶梗中茶多酚提取量的影響見圖4。

圖4 料液比對茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖4可知，茶梗中茶多酚的提取量隨溶劑體積的增大而差異顯著（P＜0.05），當料液比 1 ∶20（g/mL）時達到最大值，為70.90 mg/g，隨著溶劑體積繼續(xù)增大提取量迅速下降，在料液比1∶30（g/mL）時得到最小值44.53 mg/g。原因為溶劑較少時，受到傳質(zhì)阻力影響，茶多酚浸出量?。辉谝欢ǖ牧弦罕确秶鷥?nèi)，傳質(zhì)阻力減弱，茶多酚溶出量會升高，但當溶劑過量時，不能再加速茶多酚的浸出率[20]。因此，確定料液比1∶20（g/mL）為最佳。

2.1.5 酶解溫度的確定

不同酶解溫度對茶梗中茶多酚提取量的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖5可知，不同酶解溫度對茶梗中茶多酚提取量影響顯著（P＜0.05），在 30℃～50℃范圍內(nèi)，茶多酚提取量隨著溫度升高而增加，在50℃時達到80.76 mg/g的最大值，復(fù)合酶發(fā)揮最大活性與穩(wěn)定性，達到了復(fù)合酶的最適反應(yīng)溫度，最大程度地使細胞壁破裂，使茶多酚充分溶出；隨著溫度逐漸升高，酶蛋白質(zhì)變性失活，酶活性下降，提取量也顯著降低，在70℃時僅有53.32 mg/g，為最大值的66.02%。因此，確定最適的酶解溫度以50℃最佳。

2.1.6 酶解時間的確定

不同酶解時間對茶梗中茶多酚提取量的影響見圖6。

圖6 酶解時間對茶梗中茶多酚提取量的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction of tea polyphenol in tea stalks

由圖6可知，在30 min～50 min范圍內(nèi)，隨著酶解時間的延長，茶梗中茶多酚提取量顯著提高（P＜0.05），在50 min時，達到82.80 mg/g的最大提取量；超過50 min后，茶多酚提取量呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢。原因是提取時間過短，酶解作用不充分，延長酶解時間對提高茶多酚提取量無意義，且存在抑制酶活性的現(xiàn)象。因此，確定酶解時間以50 min適宜。

2.2 響應(yīng)面模型建立與分析

響應(yīng)面分析試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗及結(jié)果Table 2 Response surface methodology and analysis results

利用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到茶多酚提取量與復(fù)合酶添加量（A）、料液比（B）、酶解溫度（C）的回歸模型方程為：Y=83.74-2.22A+0.48B-5.76C+2.21AB+1.19AC+1.15BC-8.43A2-7.39B2-5.37C2。

方差分析見表3。

由Design-Expert 8.0軟件分析結(jié)果，對試驗方差及擬合程度進行綜合分析。該試驗?zāi)Ｐ偷腜<0.000 1，呈極顯著；失擬項P=0.502 0，不顯著，表明該模型真實可靠具有可信度[21]。3個因子對Y（茶多酚提取量）的影響大小為：C（酶解溫度）>A（復(fù)合酶添加量）>B（料液比）。一次項中A、C呈極顯著，B為顯著；二次項 A2、B2、C2和交互項 AB、AC、BC 均為極顯著。相關(guān)系數(shù)R2=0.998 2，校正相關(guān)系數(shù)R2adj=0.995 9，表明模型可解釋99.59%的響應(yīng)值變化；R2=0.998 2，表明響應(yīng)值的變化有99.82%來源于所選變量，且信噪比為13.33，證明該模型擬合程度好，可用于分析和預(yù)測茶梗中茶多酚的提取工藝。

2.3 響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化

各響應(yīng)因素交互作用對茶多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖7。

表3 茶多酚提取量的回歸方程方差分析Table 3 Analysis and statistical parameters of regression model of tea polyphenols content

由圖7（a）可知，復(fù)合酶添加量與料液比對茶多酚提取量影響的響應(yīng)曲面坡度較為陡峭，其等高線均呈橢圓形且曲線較為密集，表明復(fù)合酶添加量和料液比的交互效應(yīng)對茶多酚提取量的影響較為顯著。同時，茶多酚提取量隨溶劑體積的升高和復(fù)合酶添加量的增加呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢，并且復(fù)合酶添加量的變化曲面較料液比的變化曲面更陡峭，說明復(fù)合酶添加量對茶梗中茶多酚提取量的影響更明顯。

由圖7（b）可知，復(fù)合酶添加量與酶解溫度對茶多酚提取量影響的響應(yīng)曲面坡度均較陡峭，其等高線均呈橢圓形且曲線密集，表明復(fù)合酶添加量與酶解溫度的交互效應(yīng)對茶梗中茶多酚提取量的影響顯著，與方差分析結(jié)果相符。同時，茶多酚提取量隨復(fù)合酶添加量的增加和酶解溫度的升高呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢，并且酶解溫度的變化曲面較復(fù)合酶添加量的變化更陡峭，說明酶解溫度對茶梗中茶多酚提取量的影響更明顯。

由圖7（c）可知，料液比與酶解溫度對茶多酚提取量影響的響應(yīng)曲面坡度較為陡峭，但其等高線均呈橢圓形且曲線較為密集，表明料液比與酶解溫度的交互效應(yīng)對茶梗中茶多酚提取量的影響顯著，與方差分析結(jié)果相符。同時，茶多酚提取量隨酶解溫度的升高和溶劑體積的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并且酶解溫度的變化曲面較料液比的變化更為陡峭，說明酶解溫度對茶梗中茶多酚含量的影響更明顯。

圖7 各響應(yīng)因素交互作用對茶多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 The response surface and contour plots of the interaction of each factor to the extraction amount of tea polyphenols

2.4 最佳條件確定與回歸模型的驗證

通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到酶法提取茶梗中茶多酚最佳工藝條件為：復(fù)合酶添加量1.18%，料液比1∶19.86（g/mL），酶解溫度47.86℃，此條件下得到茶多酚提取量為82.79 mg/g。為便于實際操作，提取工藝條件調(diào)整為：復(fù)合酶添加量1.2%，料液比1∶20（g/mL），酶解溫度48℃，在此參數(shù)下進行3次重復(fù)試驗，茶多酚提取量平均值為82.26 mg/g，與理論值接近，表明響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取茶梗中茶多酚的工藝結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本研究以烏龍茶類鐵觀音茶梗中的茶多酚提取量為考察目標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化茶梗中茶多酚的提取工藝，最終得到茶多酚提取最佳工藝參數(shù)為：復(fù)合酶添加量1.2%，料液比1∶20（g/mL），酶解溫度48℃。在此參數(shù)下，鐵觀音茶梗中茶多酚提取量為82.26 mg/g，接近預(yù)測提取量82.79 mg/g，較其它提取方法結(jié)果更高，說明此試驗?zāi)Ｐ徒Y(jié)果可靠。同時，獲得鐵觀音茶梗中茶多酚提取的因素影響大小為：酶解溫度>復(fù)合酶添加量>料液比，研究結(jié)果將為烏龍茶類的茶梗附加值開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。