劉國紅，張惠南，張敏，劉娟，李淑靜，*

（1.天津海關(guān)動植物與食品檢測中心，天津300461；2.天津天獅學(xué)院，天津301700）

結(jié)晶紫，以N，N-二甲基苯胺為原料，經(jīng)過加工得到成品，是一種三苯基甲烷染料[1]。結(jié)晶紫用途廣泛，多用于消毒、殺菌、生物染色劑、獸藥、飼料等。結(jié)晶紫以其殺菌效果好，保鮮效果佳的特點，多年來廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)品長途運輸。然而，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)晶紫易被生物組織吸收，在生物體內(nèi)代謝后生成具有致癌、致畸、高毒、高殘留特性的隱性結(jié)晶紫[2-4]。目前很多國家地區(qū)都將結(jié)晶紫列為水產(chǎn)養(yǎng)殖的禁用藥物，我國目前也將結(jié)晶紫列為可食用動物禁用獸藥。

近年來，可食用動物中違規(guī)使用結(jié)晶紫等藥品的情況備受關(guān)注。歐盟要求水產(chǎn)品中結(jié)晶紫不得檢出。2005年，我國發(fā)布實施的GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》[5]規(guī)定結(jié)晶紫的檢測限為 2.0 μg/kg。

然而，檢測過程中時常遇到試劑空白檢出結(jié)晶紫，以及分析結(jié)果穩(wěn)定性差的現(xiàn)象。國內(nèi)有學(xué)者對結(jié)晶紫檢測做了相關(guān)研究。吳淑秀等[6]應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定了實驗室檢測過程中常用的筆、紙、標(biāo)簽、樣品袋等用品中結(jié)晶紫的含量。結(jié)果表明，大部分供試物品均含有一定量的結(jié)晶紫，其中A4打印紙、標(biāo)簽紙和圓珠筆中含量很高。高華鵬等[7]采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定了結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的含量，結(jié)果顯示出實驗室用品均能檢出結(jié)晶紫。許榮富等[8]用反相柱成功地分離出了結(jié)晶紫、甲基紫、堿性品藍(lán)、堿性艷藍(lán)B、銅酞菁和羅丹明B等幾種有色染料成分，檢測出圓珠筆的結(jié)晶紫含量。

本文針對水產(chǎn)品檢測過程中結(jié)晶紫檢測干擾因素進(jìn)行分析，在不同的時間條件下，對試驗可能接觸的辦公用品如紙、筆、標(biāo)簽紙，以及包裝材料如留樣用塑料袋中的結(jié)晶紫含量進(jìn)行檢測，從而得出隨時間變化的干擾因素對檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

A4打印紙、送樣樣品標(biāo)簽紙、激光打印標(biāo)簽紙、黑色簽字筆、黑色馬克筆、藍(lán)色圓珠筆：得力集團(tuán)有限公司；實驗室濾紙：塘玻（天津）實驗儀器銷售有限公司；留樣用塑料袋：河源市華豐塑膠有限公司。

乙腈（色譜純）：德國默克公司；乙酸銨（優(yōu)級純）：天津科密歐化學(xué)試劑公司；結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫：德國Dr.Ehrensorfer公司。

1290/6460超 高效液質(zhì)聯(lián)用儀、Eclipse Plus色譜柱C18（5μm×100mm×2.1mm）：德國 Agilent公司；AL204-IC電子天平：上海梅特勒-托利多儀器；WAT200609固相萃取裝置：沃特世Waters公司；HS501振蕩器：IKA公司；1 mL/cc一次性使用無菌注射器：浙江華福醫(yī)用器材有限公司；尼龍膜過濾器（0.22 μm，13 mm）：博納艾杰爾科技有限公司；1 mL進(jìn)樣瓶：浙江愛吉仁科技有限公司；2 mL塑料滴管：上海晶安生物信息有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

0.1 μg/mL的結(jié)晶紫工作液的配制：精確移取0.01 mL 0.1 mg/mL的結(jié)晶紫中間液，置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線于4℃以下避光儲存搖勻備用。

1.2.2 樣品前處理

將待測的A4紙、實驗室濾紙、送樣樣品標(biāo)簽紙、激光打印標(biāo)簽紙和留樣用塑料袋分別裁剪成2 cm×2 cm同樣大小的紙片，如圖1所示。把待測所用黑色簽字筆、黑色馬克筆、藍(lán)色圓珠筆分別在2 cm×2 cm的空白實驗室濾紙上用力均勻[9]地分別書寫一條、兩條、四條長度為兩厘米的印記并晾干，如圖2所示。加入2 mL乙腈浸提5 min，渦旋振蕩5 min。浸提液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

圖1 紙樣品前處理Fig.1 Pre-processing of paper sample

圖2 筆樣品前處理Fig.2 Pre-processing of pen sample

1.2.3 不同提取時間對污染物含量影響

將裁剪好的相同濾紙中畫相同兩條黑色簽字筆印記的紙、畫有相同黑色馬克筆印記的濾紙、畫有相同藍(lán)色圓珠筆印記的濾紙、相同送樣樣品標(biāo)簽紙、相同激光打印標(biāo)簽紙、相同留樣用塑料袋分別放入50 mL離心管中，加入2 mL乙腈分別浸提5、10、30、60、120、240、360 min 和 720 min，浸提液經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾后用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測污染物（顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫）含量。重復(fù)5次作為平行試驗，從而減小誤差。

1.2.4 儀器條件

1.2.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18，1.8 μm×100 mm×2.1 mm（內(nèi)徑）；流動相：A為500 mL乙腈+500 μL甲酸+0.385 g乙酸銨，B 為乙腈；流速：300 μL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient condition of mobile phase

1.2.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiplereactionmonitoring，MRM）；電噴霧電壓：4 000 V；殼氣溫度：350℃；離子源溫度：300℃。

顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫檢測的質(zhì)譜條件見表2。

表2 顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometer conditions for gentian violet and leuco gentian violet

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確分別吸取結(jié)晶紫的標(biāo)準(zhǔn)工作液0、1、5、10、20、50、100 μL 至進(jìn)樣瓶內(nèi)，依次分別加入乙腈 1 000、999、995、990、980、950、900 μL 至每個進(jìn)樣瓶內(nèi)，配制成濃度為 0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L 的結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)液。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液置于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，在最佳色譜條件下進(jìn)行色譜分析，以保留時間定性，測定峰面積定量。以結(jié)晶紫及其代謝物濃度為橫坐標(biāo)，以結(jié)晶紫及其代謝物的液相峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的檢出限

圖3和圖4分別為0.05 μg/L顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的選擇離子色譜圖。

圖3 0.05 μg/L顯性結(jié)晶紫選擇離子色譜圖Fig.3 MRM chromatography for 0.05 μg/L gentian violet

圖4 0.05 μg/L隱性結(jié)晶紫選擇離子色譜圖Fig.4 MRM chromatography for 0.05 μg/L leuco gentian violet

在0.5 μg/L濃度下，顯性結(jié)晶紫的信噪比S/N=17.5，隱性結(jié)晶紫的信噪比S/N=71.9，均大于3，按照GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》規(guī)定，S/N＞3可以定義為檢出限。因此本方法中顯性結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫的檢出限定為0.5 μg/L。由圖3和圖4可得，該試驗條件測得的顯性結(jié)晶紫的保留時間為5.81 min，隱性結(jié)晶紫的保留時間為7.52 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.5的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以結(jié)晶紫的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=150 049.37X+12 345.95，相關(guān)系數(shù) R2＝0.995 7，線性范圍為 0～5 μg/L，線性關(guān)系良好。

以隱性結(jié)晶紫的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=56 370.42X-2 861.45，相關(guān)系數(shù) R2＝0.999 5，線性范圍為 0～5 μg/L，線性關(guān)系良好。

2.3 結(jié)晶紫隨時間變化的含量分析

6種待分析樣品結(jié)晶紫殘留含量結(jié)果見表3。

表3 結(jié)晶紫隨時間變化的含量分析Tab.3 Analysis on the content of gentian violet changed over time

由表3可得出在對6種待分析樣品分別浸提5、10、30、60、120、240、360 min 和 720 min 后檢測結(jié)晶紫含量，黑色簽字筆劃線紙沒有檢出顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫含量，黑色馬克筆劃線紙和留樣用塑料袋中沒有檢出隱性結(jié)晶紫含量。在5 min～720 min內(nèi)黑色馬克筆劃線紙中的顯性結(jié)晶紫含量隨時間的延長而增加。在720 min時達(dá)到頂峰，其濃度為0.30 μg/L。其原因可能是由于隨時間的增加馬克筆油墨中的染料含有的污染物不斷析出[10]。在5 min～720 min內(nèi)藍(lán)色圓珠筆劃線紙中顯性結(jié)晶紫含量非常高且隨時間的加長而增加，在720 min時達(dá)到頂峰，其濃度為392.96 μg/L。其隱性結(jié)晶紫含量也隨時間的延長而增加。藍(lán)色圓珠筆劃線紙中含有的顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫含量非常高，原因可能是由于圓珠筆油墨中的染料含有結(jié)晶紫所以對試驗造成了極大的污染，并且隨時間增加污染物在不斷的析出[9]。送樣樣品標(biāo)簽紙中顯性結(jié)晶紫隨時間的延長而增加，其濃度在720 min時達(dá)到頂峰濃度為51.30 μg/L。其隱性結(jié)晶紫含量也隨時間的加長而增加。其原因可能是由于實驗室標(biāo)簽紙在生產(chǎn)運輸時受到結(jié)晶紫的污染。激光打印標(biāo)簽紙中顯性結(jié)晶紫隨時間的加長而增加，其隱性結(jié)晶紫含量也基本隨時間的加長而增加，其原因可能是由于激光打印的墨汁中含有結(jié)晶紫。留樣用塑料袋中顯性結(jié)晶紫含量整體隨時間的加長而增加。存在顯性結(jié)晶紫的原因可能是由于在塑料袋的保存和運輸過程中受到含有結(jié)晶紫物質(zhì)的污染。

3 結(jié)論與討論

本文研究超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品測定過程中可能存在的干擾因素，包括水產(chǎn)品的樣品采集、流通，以及實驗室檢測過程中可能被污染的包裝材料樣本中結(jié)晶紫含量隨時間變化的情況。除了黑色簽字筆劃線紙沒有測定出顯性及隱性結(jié)晶紫以外，在黑色馬克筆劃線紙、藍(lán)色圓珠筆劃線紙、送樣樣品標(biāo)簽紙、激光打印標(biāo)簽紙、留樣用塑料袋中顯性結(jié)晶紫的含量變化趨勢一致，都隨時間的延長有增長趨勢。藍(lán)色圓珠筆劃線紙中的隱性結(jié)晶紫含量也很高，5 min～720 min時隱性結(jié)晶紫從8.18 μg/L升高到15.90 μg/L，隨時間延長含量出現(xiàn)了增長。送樣樣品標(biāo)簽紙、激光打印標(biāo)簽紙中隱性結(jié)晶紫含量也有了不同程度的檢出，同樣隨時間延長出現(xiàn)了增長。黑色馬克筆劃線紙、留樣用塑料袋中沒有檢出隱性結(jié)晶紫。

綜上所述，結(jié)晶紫（含顯性結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫）檢測結(jié)果在樣品采集、傳遞及實驗室檢測過程中會受包裝材料的影響，原因是馬克筆、圓珠筆，激光打印的墨粉中的結(jié)晶紫染料可能析出，染料中析出的結(jié)晶紫檢出值隨時間延長而升高。該研究為探索水產(chǎn)品中結(jié)晶紫檢測受包裝材料的影響情況提供了依據(jù)，為結(jié)晶紫檢測假陽性研究提供了參考。