金丹丹　房巖　費瑞　郝鳳桐　馬金理　楊文卓

摘 要：白英含有多種化學成分，具有潛在的藥用價值和開發(fā)前景，但抗炎機制的研究并不完整。本實驗以小鼠RAW264.7細胞為材料，研究白英甾體化合物的抗炎作用機制，研究發(fā)現(xiàn)：白英甾體化合物能明顯抑制產生炎癥的小鼠RAW264.7細胞的TNF-α的炎癥因子的表達，提高炎癥細胞的線粒體膜電位，白英甾體化合物可能是通過保護線粒體來實現(xiàn)其抗炎作用。

關鍵詞：白英甾體化合物;TNF-α;線粒體膜電位;抗炎

中圖分類號：S-3 文獻標識碼：A DOI：10.19754/j.nyyjs.20201130001

炎癥是機體自發(fā)產生的一種正常反應，但如果反應過度，又會給機體帶來損傷。如何有效控制炎癥的過度損傷，減輕炎癥對身體帶來的危害，是如今所要研究的重要課題，對人類健康具有重要意義[1]。白英，又叫鬼目草、葫蘆草等，是茄科茄屬植物，屬多年生蔓性草本植物，分布十分廣泛[2]。白英有很大的藥用價值，其全草以及根部都可供藥用。目前臨床上對于白英的應用越來越多，在消腫解毒、抗腫瘤等方面尤為顯著。近年來，各研究學者開始對白英的抗炎作用進行研究，發(fā)現(xiàn)白英具有較好抗炎效果。研究表明，白英主要通過其各種化學成分發(fā)揮作用[3]。TNF-α是非常重要的一種炎癥因子，能夠反映細胞的炎癥水平，抑制TNF-α的表達，可以達到抗炎的目的。線粒體是真核生物非常重要的細胞器，在機體中發(fā)揮重要的作用，當機體產生炎癥時，線粒體會發(fā)生很明顯的變化，包括上調ROS水平、降低線粒體膜電位等，可以通過這些指標來觀察線粒體的情況，因此，研究白英甾體化合物的抗炎作用與對線粒體的關系具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

細胞培養(yǎng)箱;超凈工作臺;酶標儀;倒置顯微鏡;電子天平;低速離心機;熒光顯微鏡等。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基;胎牛血清;PBS;雙抗;CCK-8試劑;TNF-α的ELISA檢測試劑盒;線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）。

1.3 藥品與細胞

白英甾體化合物干粉由吉林省中醫(yī)中藥研究院饋贈，利用PBS使其溶解，實驗所需細胞為小鼠RAW264.7細胞購自中國細胞庫，對照組為地塞米松。

2 方法

2.1 藥品配制及細胞培養(yǎng)

取白英甾體化合物的干粉，用PBS將其溶解，然后過濾并進行高壓滅菌。小鼠RAW264.7細胞用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，加入胎牛血清和雙抗（青霉素、鏈霉素），在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期可供實驗使用。

2.2 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞活力的影響

取培養(yǎng)的小鼠RAW264.7細胞，加入培養(yǎng)基并輕輕吹打，使細胞懸浮到液體中，加入到96孔板中，使每孔體積200μL，細胞密度為1×104mL/個，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁生長，然后把孔內液體吸出，加入含有不同濃度的白英甾體化合物的DMEM培養(yǎng)基，并加入LPS，分為5組：空白組，白英甾體化合物高、中、低劑量組（白英甾體化合物的濃度分別為40μg·mL-1、20μg·mL-1、5μg·mL-1），地塞米松陽性對照組[4]。

2.3 CCK-8法測定細胞活力

上述5組作用24h后，每孔加入10μLCCK-8，靜置30min，把酶標儀的波長調至450nm，測定上述各孔吸收的OD值。

2.4 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞TNF-α表達的影響

細胞培養(yǎng)同上所述，分組情況同上，按照TNF-α的ELISA檢測試劑盒的說明書進行操作，測量小鼠RAW264.7的炎癥因子的表達情況。

2.5 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響

在上述培養(yǎng)的細胞中，加入脂多糖，按照分組濃度，加入白英甾體化合物，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每組取1×105個細胞，重懸于0.5mL細胞培養(yǎng)液中，按照線粒體膜電位檢測試劑盒的說明書進行操作，以測定線粒體膜電位的變化情況[5]。

2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

使用Graphpad Prism 5.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

3 結果

3.1 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞活力的影響

結果顯示，與空白組相比較，白英甾體化合物的高中低劑量組和陽性對照組細胞活性明顯偏低，白英甾體化合物的高中低劑量組又高于地塞米松組，但各組之間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。說明在試驗濃度范圍內，不同濃度的甾體化合物和地塞米松不影響小鼠RAW264.7細胞活性，對小鼠RAW264.7細胞沒有毒性作用，與林世和等研究結果一致[6]。

3.2 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞TNF-α表達的影響

結果顯示，與空白組比較，LPS顯著提升了小鼠RAW264.7細胞TNF-α的表達，其差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明LPS誘導細胞產生炎癥，模型構建成功。與LPS組比較，40μg·mL-1和20μg·mL-1的甾體化合物與地塞米松能夠抑制小鼠RAW264.7細胞TNF-α的表達，其差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明白英甾體化合物具有較好的抗炎作用。5μg·mL-1的甾體化合物則沒有顯示出抑制小鼠RAW264.7細胞TNF-α的表達的作用，對比LPS組，其差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明白英甾體化合物濃度較低時，其作用效果不明顯，與劉淑華等研究結果一致[4]。

3.3 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響

通過JC-1法測定線粒體膜電位，用紅、綠2種顏色的熒光分別表示線粒體膜電位的高、低。結果顯示，空白組呈現(xiàn)紅色熒光，LPS組為綠色熒光，說明在LPS的刺激下，細胞產生炎癥;當加入白英甾體化合物后，線粒體膜電位有所提高，并且以劑量依賴性的方式增強線粒體膜電位，說明炎癥反應得到抑制。

4 討論

試驗以小鼠RAW264.7細胞為試驗材料，通過LPS刺激誘導細胞產生炎癥，以研究白英甾體化合物的抗炎作用與功效[7]。試驗首先研究了白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞的毒性作用，結果顯示，白英甾體化合物和地塞米松對細胞活性有影響，使細胞活力OD值下降，但各組之間無統(tǒng)計學差異，說明白英甾體化合物對細胞沒有毒性作用。TNF-α是炎癥反應的一個重要指標，通過ELISA檢測了各組TNF-α的表達水平，LPS刺激細胞產生炎癥，TNF-α的表達較高，但在白英甾體化合物作用的情況下，中、高濃度明顯抑制了TNF-α的表達，具有統(tǒng)計學差異，低濃度則沒有出現(xiàn)抑制作用，沒有統(tǒng)計學差異，說明低濃度的白英甾體化合物抗炎作用不明顯。為了明確白英甾體化合物的抗炎機制，通過JC-1法測量了線粒體膜電位，空白組呈紅色熒光，線粒體膜電位較高，LPS刺激后，呈現(xiàn)綠色熒光，膜電位下降，白英甾體化合物作用后，紅色熒光比例提高，說明白英明顯提高了線粒體膜電位。由此得出結論，白英甾體化合物能明顯抑制產生炎癥的小鼠RAW264.7細胞的TNF-α的炎癥因子的表達水平，提高炎癥細胞的線粒體膜電位，白英甾體化合物可能是通過保護線粒體來實現(xiàn)其抗炎作用[8]。

參考文獻

[1]蔡艷春，黃倩，危曉莉，等.紅景天苷對脂多糖誘導大鼠肺泡巨噬細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞共培養(yǎng)炎性介質分泌的影響[J].生理學報，2019，71（04）：575-580.

[2]孫立新，畢開順，王敏偉.中藥白英的研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2006（04）：251-255.

[3]孫立新，任靖，王敏偉，等.白英水提物抗腫瘤作用的初步研究[J].中草藥，2006（01）：98-100.

[4]劉淑華，毛曉紅，魏仙鳳.白英甾體皂苷對HeLa細胞增殖的高效抑制作用及機制研究[J].山東中醫(yī)雜志，2009，28（10）：724-726.

[5]韓孝先，劉澤宇，周慶彪，等.線粒體在炎癥調控中的作用研究進展[J].癌變·畸變·突變，2017，29（06）：467-470，475.

[6]林世和，易艷東，余南才.白英總皂苷的抗炎活性研究[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2016，36（07）：564-567.

[7]張麗嬌，高立宏，費瑞.銀杏葉多糖對炎癥小鼠TNF-α表達的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018（16）：172-173.

[8]劉芬，曾振國，李勇，等.體DNA誘導肺泡巨噬細胞炎癥反應的實驗研究[J].南昌大學學報（醫(yī)學版），2014，54（01）：1-3.

（責任編輯 李媛媛）

收稿日期：2020-10-23

基金項目：吉林省自然科學基金項目“吉林省科技發(fā)展計劃項目白英的抗炎活性成分及以TLR4為靶點的相關機制研究”（項目編號：20180101112JC）;國家自然科學基金項目（項目編號：50875108）

作者簡介：金丹丹（1995-），女，碩士在讀。研究方向：功能生物學;費瑞（1964-），男，博士，教授。研究方向：生物活性物質活性;郝鳳桐（1997-），男，碩士在讀。研究方向：生物學;馬金理（1997-），男，本科在讀;楊文卓（1999-），男，本科在讀;通訊作者房巖（1965-），女，博士，教授。研究方向：動物學和工程仿生學。