覃江鋒 徐玉嬋 韋朔峰 韋小妮 王文丹 韋德寧 羅世強(qiáng) 韋 相 袁德健 蔡 稔 唐 寧

(廣西柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，柳州市 545001，電子郵箱：308715957@qq.com)

Klinefelter綜合征是男性中最常見的性染色體異常疾病，發(fā)病率約為1.72‰,而在男性不育人群中其發(fā)病率為3.1%，在無精子癥人群中約為10%[1]。Klinefelter綜合征的典型體征表現(xiàn)為身材高大、性發(fā)育不良和男性乳房發(fā)育[2]，部分患者的智商稍低于正常人，有精神異?；蚓穹至寻Y的傾向，少數(shù)患者可有乳腺癌、糖尿病、甲狀腺功能低下、性腺細(xì)胞癌等。目前關(guān)于Klinefelter綜合征產(chǎn)前篩查與診斷的研究報(bào)道很少。本文擬通過回顧性分析在我院行羊膜腔穿刺取羊水細(xì)胞進(jìn)行胎兒染色體核型分析的18 318例樣本檢測(cè)結(jié)果及產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷等臨床資料，并追蹤其妊娠結(jié)局，分析Klinefelter綜合征在產(chǎn)前的檢出情況，并總結(jié)其臨床表征、產(chǎn)前診斷方法等臨床特點(diǎn)，旨在為Klinefelter綜合征的產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 納入2015年1月至2019年6月期間，在我院于適宜孕周經(jīng)羊膜腔穿刺取羊水細(xì)胞進(jìn)行胎兒染色體核型分析的18 318例孕婦，年齡為15～48歲，孕周為17～25周。納入孕婦均符合產(chǎn)前診斷指征，包括高齡孕婦(預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲)、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)、產(chǎn)前超聲檢查提示胎兒結(jié)構(gòu)異常、孕婦既往有過不良孕產(chǎn)史、夫婦一方有染色體異常家族史或曾生育過患有染色體病的兒女等。所有孕婦術(shù)前均簽署知情同意書。

1.2 染色體核型分析方法

1.2.1 標(biāo)本采集：常規(guī)消毒后在B超引導(dǎo)下,孕婦經(jīng)腹行穿刺術(shù)抽取羊水,每位孕婦抽取15～20 mL，分成2份分別置于15 mL無菌離心管中運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2.2 染色體核型分析：分兩線接種，一人一線,獨(dú)立操作。將離心管以1 800 r/min離心10 min棄部分上清，留2.5 mL羊水吹打管底沉淀制備成細(xì)胞懸液，接種于加有3 mL羊水培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、6.5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7～8 d換液，棄上清，加入新鮮的羊水培養(yǎng)基3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后再行鏡下觀察；如羊水細(xì)胞克隆生長(zhǎng)良好，即可加入濃度為20 μg/mL的秋水仙素40～60 μL，4～6 h后收獲細(xì)胞；如羊水細(xì)胞克隆生長(zhǎng)不佳，則進(jìn)行傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。常規(guī)制片，G顯帶后兩線共計(jì)數(shù)20個(gè)分裂象，分析6個(gè)核型，異常核型者增加計(jì)數(shù)和分析量，核型描述按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體系(ISCN2016)》[3]進(jìn)行。

1.3 資料收集 收集所有孕婦年齡、孕產(chǎn)史、穿刺孕周，夫妻雙方相關(guān)病史，產(chǎn)前診斷指征；收集Klinefelter綜合征病例的妊娠結(jié)局，產(chǎn)前超聲檢查、血清學(xué)篩查、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(non-invasive prenatal testing， NIPT)結(jié)果，以及接受其他產(chǎn)前診斷的情況及結(jié)果，包括多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)、基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序(copy number variation sequencing，CNV-seq)等。

2 結(jié) 果

2.1 Klinefelter綜合征檢出情況及妊娠結(jié)局 18 318例羊水產(chǎn)前診斷(染色體核型分析)樣本中，檢出34例Klinefelter綜合征，發(fā)生率為1.86‰，且以典型的47,XXY最為常見，僅6例孕婦選擇繼續(xù)妊娠，見表1。在34例Klinefelter綜合征中，發(fā)現(xiàn)1例罕見核型48，XXYY：該孕婦27歲，孕10產(chǎn)1,自然流產(chǎn)4次，人流4次，曾剖宮產(chǎn)1子(中間型地貧)；此次停經(jīng)18+6周，因高齡、夫婦雙方均為α-地貧攜帶者而要求產(chǎn)前診斷；胎兒羊水同時(shí)采用MLPA技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果提示X染色及Y染色體峰位置均呈兩倍體峰，與染色體核型分析結(jié)果一致(見圖1、圖2)。

表1 34例Klinefelter綜合征的染色體核型分布和妊娠結(jié)局

圖1 48，XXYY胎兒羊水細(xì)胞G顯帶染色體核型圖

圖2 48，XXYY胎兒羊水 MLPA結(jié)果

2.2 Klinefelter綜合征病例的產(chǎn)前篩查及其他產(chǎn)前檢查情況 34例孕婦均接受了產(chǎn)前超聲檢查，僅2例存在異常；僅部分孕婦接受了產(chǎn)前血清學(xué)篩查、NIPT篩查及MLPA、CNV-seq等產(chǎn)前診斷，見表2。

3 討 論

Klinefelter綜合征是一種因性染色體數(shù)目異常而引起多種表型異常的常見綜合征。本研究的18 318例羊水產(chǎn)前診斷(染色體核型分析)孕婦中，共檢測(cè)出34例Klinefelter綜合征，發(fā)生率為1.86‰，且以典型的47,XXY為最常見核型，這與相關(guān)研究結(jié)果相符[1-2,4]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)1例48，XXYY核型，是Klinefelter綜合征中較罕見的類型，國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道。Kemeny等[5]發(fā)現(xiàn)的1例48，XXYY綜合征產(chǎn)前診斷病例，因羊水過多行孕中期超聲檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)馬蹄足。國(guó)內(nèi)馮亞佩等[6]報(bào)告1 例48，XXYY綜合征產(chǎn)前診斷病例，引產(chǎn)胎兒表現(xiàn)為眼距寬，無其他明顯外觀異常。本研究中的1例48,XXYY核型在孕婦孕早期因黃體酮低進(jìn)行保胎治療，產(chǎn)前超聲檢查中未見明顯異常，出生后體查發(fā)現(xiàn)陰囊小，但B超提示生殖器結(jié)構(gòu)正常，其他未見明顯異常。因此，我們推測(cè)該病在胎兒期不一定有特殊表現(xiàn)，而在出生后可發(fā)現(xiàn)患者存在發(fā)育異常，但是早期發(fā)現(xiàn)該病并盡早給予針對(duì)性干預(yù)，可能會(huì)更有利于其后期各個(gè)器官的發(fā)育。傳統(tǒng)的血清學(xué)產(chǎn)前篩查主要針對(duì)21-三體綜合征、18-三體綜合征和神經(jīng)管缺陷，并沒有針對(duì)包括Klinefelter綜合征在內(nèi)的性染色體異常。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在開展唐氏綜合征篩查的國(guó)家中，性染色體非整倍體檢出率低于50%，認(rèn)為用于檢測(cè)唐氏綜合征的方法不能擴(kuò)展到檢測(cè)性染色體非整倍體[7]。本研究確診的34例Klinefelter綜合征病例中，有11例孕婦做了血清學(xué)產(chǎn)前篩查，其中有7例提示21-三體高風(fēng)險(xiǎn)，2例提示18-三體高風(fēng)險(xiǎn)，1例提示開放性神經(jīng)管缺陷高風(fēng)險(xiǎn)。造成假陽(yáng)性的原因除了血清學(xué)產(chǎn)前篩查本身方法學(xué)的局限性外，Klinefelter綜合征胎兒是否會(huì)影響母體性激素變化導(dǎo)致孕周推算錯(cuò)誤，進(jìn)而影響產(chǎn)前篩查風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，這仍有待進(jìn)一步研究。

產(chǎn)前胎兒超聲檢查對(duì)Klinefelter綜合征無特異性，本研究中胎兒超聲檢查除了1例為未見鼻骨，1例雙胎表現(xiàn)為兩胎兒體重相差10%外，其余未見明顯異常。但是，孕婦外周血NIPT對(duì)胎兒性染色體非整倍體疾病具有較高的準(zhǔn)確性：一項(xiàng)針對(duì)NIPT的臨床應(yīng)用及隨訪研究顯示，NIPT對(duì)性染色體XXY的檢出率及檢測(cè)準(zhǔn)確性均為100%[8]；Zheng等[9]研究發(fā)現(xiàn),NIPT對(duì)Klinefelter綜合征的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%；周琴等[10]通過對(duì)12 071例孕婦進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，15例孕婦的NIPT檢測(cè)結(jié)果提示Klinefelter綜合征高風(fēng)險(xiǎn)，其中10例孕婦接受了羊水細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷，7例為真陽(yáng)性。本研究結(jié)果也顯示，在確診的34例Klinefelter綜合征產(chǎn)前診斷樣本中，有15例孕婦產(chǎn)前接受了NIPT篩查，均提示性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)，符合率100%。雖然關(guān)于NIPT對(duì)性染色體異常的診斷價(jià)值目前仍沒有統(tǒng)一的共識(shí)，但由于其具有較高的診斷準(zhǔn)確性，或可作為Klinefelter綜合征產(chǎn)前篩查的有效手段。

染色體核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)的經(jīng)典方法，是自20世紀(jì)70年代以來診斷胎兒染色體非整倍體異常的“金標(biāo)準(zhǔn)”。近年來，隨著醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，熒光原位雜交技術(shù)、定量熒光PCR、MLPA、CNV-seq等分子診斷技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體的快速產(chǎn)前診斷。MLPA技術(shù)具有高效率、低成本、高通量、操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，在單管里可一次性完成多達(dá)50個(gè)位點(diǎn)拷貝數(shù)變異的檢測(cè)，對(duì)快速識(shí)別13-三體，18-三體，21-三體以及性染色體較大片段的缺失和重復(fù)均具有良好的效果[11-13]；其局限性是靶向檢測(cè)目標(biāo)疾病，對(duì)染色體低比例的嵌合體、三倍體、平衡倒位、易位及未覆蓋探針區(qū)域的缺失、重復(fù)等無法檢測(cè)[14-15]。Kooper等[16]的研究結(jié)果提示，異常核型細(xì)胞克隆比例未達(dá)到20%的嵌合體則無法被MLPA技術(shù)檢出。本研究34例Klinefelter綜合征病例中，有22例接受了MLPA檢測(cè)，其中有21例與染色體核型分析檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為95.5%(21/22)，僅有1例染色體核型為47,XXY[10]/46,XY[82]的病例因嵌合比例低，MLPA無法檢出。因此，MLPA技術(shù)可以為Klinefelter綜合征患者提供更為精確的臨床診斷。

Klinefelter綜合征目前沒有根治的方法，但早期的對(duì)癥治療可有效改善患者的癥狀，性激素的替代治療可有效地促進(jìn)第二性征發(fā)育?；颊叽嬖跓o精或嚴(yán)重少弱精，一般無生育能力，可借助輔助生殖技術(shù)進(jìn)行生育。例如，毛加明等[17]對(duì)143例非嵌合型 Klinefelter綜合征患者行睪丸顯微切開取精術(shù)，其中有64例成功獲取精子，精子獲得率為44.76% (64/143)，而成功獲取精子的34例患者中，臨床妊娠率為73.53%(25/34)。本研究對(duì)這34例Klinefelter綜合征的妊娠結(jié)局進(jìn)行隨訪，其中有6例孕婦在綜合考慮了自身年齡、生育因素以及Klinefelter綜合征現(xiàn)有診療技術(shù)的發(fā)展情況后，選擇了繼續(xù)妊娠，包括罕見核型48，XXYY病例(因夫婦雙方均為α-地貧攜帶者，且既往已有9次不良妊娠史，因而即使胎兒確診為Klinefelter綜合征，仍然自愿選擇繼續(xù)妊娠并最終生育下來)。

綜上所述，在本次產(chǎn)前診斷中Klinefelter綜合征檢出率不高，核型以典型的47,XXY最為常見。部分Klinefelter綜合征患者在胎兒期表現(xiàn)正常，而在出生后才表現(xiàn)異常的臨床表征。NIPT可以作為Klinefelter綜合征產(chǎn)前篩查的有效手段，傳統(tǒng)的染色體核型分析聯(lián)合分子診斷技術(shù)如MLPA，可以為Klinefelter綜合征患者提供更為精確的臨床診斷。如產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)胎兒為Klinefelter綜合征，應(yīng)當(dāng)提供恰當(dāng)?shù)倪z傳咨詢，及時(shí)采取干預(yù)或治療措施，從而降低男性新生兒Klinefelter綜合征的發(fā)病率并提高人口質(zhì)量。