藍(lán)俊虹，張 冰，許英蕾，王永俠，范小燕，楊彩梅*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江臨安 311300；2.浙江惠嘉生物技術(shù)股份有限公司，浙江安吉 313300)

抗生素可促進(jìn)動(dòng)物生長，防治動(dòng)物腹瀉，進(jìn)而提高生產(chǎn)性能和養(yǎng)殖效益，因此被廣泛使用。但隨著抗生素大量使用甚至濫用，其負(fù)面影響越來越突出，甚至威脅到食品安全和人類健康。據(jù)中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194 號(hào)公告，從2020 年1 月起，我國禁止飼料中添加中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種。

益生菌作為一種綠色飼料添加劑，已被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《飼料添加劑品種目錄》可使用的飼用微生態(tài)制劑有34 種，包括地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、酵母菌等。大量研究表明，益生菌具有調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群，增強(qiáng)畜禽機(jī)體免疫力和抗應(yīng)激能力，提高飼料轉(zhuǎn)化率等作用[1-3]。抗生素盡管在飼料添加劑中禁用，但在獸藥治療中依然可以使用。由于益生菌產(chǎn)品是活菌制劑，治療過程中抗生素藥物的添加與使用是否會(huì)對(duì)益生菌造成影響也一直是畜禽養(yǎng)殖中關(guān)注的問題，但是目前關(guān)于不同抗生素參與益生菌的抑制作用方面的研究較少。本試驗(yàn)采用8 種獸藥用抗生素類物質(zhì)，通過牛津杯雙層平板擴(kuò)散試驗(yàn)研究這些抗生素不同濃度下對(duì)5 種常用益生菌的抑制作用，為益生菌的合理利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種與抗生素 試驗(yàn)菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CGMCC9383]、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[CGMCC9385]、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）[CGMCC9385]、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）[CGMCC93821]、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）[CGMCC3866]均購自中國普通微生物菌種保藏中心。

試驗(yàn)抗生素：桿菌肽鋅（Zinc Bacitracin）、喹烯酮（Quinocetone）、吉他霉素（Guitarmycin）、鹽酸金霉素（Chlortetracycline Hydrochloride）、土霉素鈣（Oxytetracycline Calcium）、阿莫西林（Amoxicillin）、硫酸新霉素（Neomycin Sulfate）、硫酸粘桿菌素（Colistin Sulfate）8 種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗生素溶液樣品的配制 抗生素樣品用量及溶解與稀釋參照藥典[4]。

桿菌肽鋅溶液：分別稱取0.25、0.5、0.75 g BMD樣品，分別溶于按pH 6.0 磷酸鹽緩沖液:吡啶:5 mol/L鹽酸=31:9:20 配制的混合液中，定容至100 mL，而后用pH 為6.0 的磷酸鹽緩沖液稀釋并配成終濃度分別為25、50、75 mg/kg 樣品溶液，另取適量pH 為6.0 的磷酸鹽緩沖液作為空白溶劑對(duì)照。

喹烯酮溶液：分別稱取0.25、0.5、0.75 g 喹烯酮樣品，按喹烯酮（mg）:二甲基甲酰胺（mL）=2:1 溶解喹烯酮，而后加甲醇稀釋并定容至終濃度為25、50、75 mg/kg 樣品溶液，另取適量的甲醇作為空白溶劑對(duì)照。

吉他霉素溶液：分別稱取0.25、0.5、0.75 g 吉他霉素樣品，按吉他霉素（mg）:乙醇（mL）=2:1 溶解吉他霉素，而后加滅菌水定容至100 mL，而后分別用pH 為7.5 的磷酸鹽緩沖液稀釋配成終濃度分別為25、50、75 mg/kg 樣品溶液，另取適量pH 為7.5 的磷酸鹽緩沖液作為空白溶劑對(duì)照。

硫酸新霉素溶液：分別稱取0.25、0.5、0.75 g 硫酸新霉素樣品，加滅菌水溶解，并稀釋定容至終濃度為25、50、75 mg/kg 樣品溶液，另取適量滅菌水作為空白溶劑對(duì)照。

阿莫西林溶液：分別稱取0.25、0.5、0.75 g 阿莫西林樣品，分別溶于按0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（pH為5.0）:乙腈=39:1 配制的溶劑中，并稀釋定容至終濃度為25、50、75 mg/kg 樣品溶液，另取適量該溶液溶劑作為空白對(duì)照。

土霉素鈣溶液：分別稱取0.5、1.0、1.50 g 土霉素鈣樣品，加pH 為6.0 的磷酸鹽緩沖液溶解，并稀釋定容至終濃度為50、100、150 mg/kg 樣品溶液，另取適量pH 為6.0 的磷酸鹽緩沖液作為空白溶劑對(duì)照。

鹽酸金霉素溶液：分別稱取0.5、1.0、1.50 g 鹽酸金霉素樣品，加0.01 mol/L 鹽酸溶液中溶解，并稀釋定容至終濃度為50、100、150 mg/kg 樣品溶液，另取適量0.01 mol/L 鹽酸溶液作為空白溶劑對(duì)照。

硫酸粘桿菌素溶液：分別稱取0.5、1.0、1.50 g 硫酸粘桿菌素樣品，具體配置方法同土霉素鈣溶液。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，NaCl 10 g，用蒸餾水定容至950 mL，調(diào)節(jié)pH 至7.0，再用蒸餾水定容至1 L，121℃滅菌30 min 備用。

強(qiáng)化梭菌（RCM）固體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基37.5g（成品，購自杭州百思生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：BS1068），瓊脂17 g，加蒸餾水1 L，pH 約為7.4，121℃滅菌30 min 備用。

乳酸細(xì)菌（MRS）固體培養(yǎng)：準(zhǔn)確稱取MRS 瓊脂培養(yǎng)基66.2 g（成品，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：HB0384），瓊脂7.5 g，加蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH 至6.2～6.6（滅菌后6.0～6.5），121℃滅菌25 min 備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基46 g（成品，購自杭州百思生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：BS1123），瓊脂5 g，自來水1 L，自然pH，121℃滅菌30 min 備用。

1.2.3 菌種的活化 分別挑取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌于LB 固體培養(yǎng)基斜面上劃線接種；丁酸梭菌于RCM 固體培養(yǎng)基斜面上劃線接種；糞腸球菌于MRS 固體培養(yǎng)基斜面上劃線接種；酵母菌于PDA 固體培養(yǎng)基斜面上劃線接種。37℃培養(yǎng)48 h（丁酸梭菌于厭氧罐中培養(yǎng)），用無菌水洗脫備用。保證各菌液菌數(shù)含量為109CFU/mL。

1.2.4 牛津杯雙層平板擴(kuò)散試驗(yàn) 參照參考文獻(xiàn)[5-6]的方法。待已配置的LB、RCM、MRS、PDA 固體培養(yǎng)基冷卻至適當(dāng)?shù)臏囟龋瑹o菌條件下向已滅菌的培養(yǎng)皿（90 mm）加入15～20 mL 各培養(yǎng)基進(jìn)行封底，待第一層培養(yǎng)基充分冷卻凝固后，分別用滅菌移液器吸取已調(diào)好的供試菌0.1 mL，加入50～60℃ 100 mL 相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中（即0.1% 的加菌量），混合均勻后，加入5～7 mL 含菌液的各固體培養(yǎng)基到對(duì)應(yīng)冷凝好的培養(yǎng)基表面，使菌液分布均勻。待第二層培養(yǎng)基完全冷卻凝固后，用無菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯（φ6×8×10 mm）置于培養(yǎng)基表面，按一定順序加入適當(dāng)量的樣品溶液。而后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱18～24 h（丁酸梭菌則是置于厭氧罐中，37℃恒溫培養(yǎng)箱18～24 h）。最后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑大小。

根據(jù)抑菌圈直徑結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)[7-8]進(jìn)行抑菌能力判定：抑菌圈直徑大于20 mm 為抑菌作用極強(qiáng)，直徑15～20 mm 為抑菌作用較強(qiáng)；直徑 10～15 mm 為中度抑菌作用；直徑為7～9 mm 為抑菌作用較弱；抑菌圈直徑＜7 mm 為無抑菌作用；直徑越大，抑菌能力越強(qiáng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均至少重復(fù)3 次。所得結(jié)果圖（除特別標(biāo)注外）與表均按照?qǐng)D示進(jìn)行測(cè)量與讀取。采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析（One-Way ANOVA）。所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果及分析

從圖1 以及表1 可以看出，試驗(yàn)所用不同濃度的桿菌肽鋅、硫酸粘桿菌素以及25 mg/kg 喹烯酮對(duì)枯草芽孢桿菌均無抑制作用；50 mg/kg 土霉素鈣抑制作用較弱；50、75 mg/kg 的喹烯酮，100 mg/kg 和150 mg/kg的土霉素鈣，50、100、150 mg/kg 的鹽酸金霉素對(duì)枯草芽孢桿菌有中度的抑制作用；25、50、75 mg/kg 的吉他霉素、阿莫西林以及硫酸新霉素對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用極強(qiáng)。

圖1 不同抗生素對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用

表1 不同抗生素對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用的測(cè)定結(jié)果 mm

圖2 及表2 表明，不同濃度的桿菌肽鋅、硫酸粘桿菌素以及25 mg/kg 喹烯酮對(duì)地衣芽孢桿菌均無抑制作用；50 mg/kg 和75 mg/kg 的喹烯酮、25 mg/kg 的硫酸新霉素、不同濃度鹽酸金霉素以及土霉素鈣對(duì)地衣芽孢桿菌有中度抑制作用，50 mg/kg 硫酸新霉素的抑制作用較強(qiáng)，75 mg/kg 的硫酸新霉素則具有極強(qiáng)的抑制作用；吉他霉素對(duì)地衣芽孢桿菌的抑制作用明顯，25 mg/kg 的吉他霉素有較強(qiáng)的抑制作用，50 mg/kg 與75 mg/kg 吉他霉素表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用。此外，不同濃度的阿莫西林顯示出較強(qiáng)的抑制作用。

圖2 不同抗生素對(duì)地衣芽孢桿菌的抑制作用

表2 不同抗生素對(duì)地衣芽孢桿菌抑制作用的測(cè)定結(jié)果 mm

圖3 及表3 表明，不同濃度的桿菌肽鋅、硫酸新霉素以及硫酸粘桿菌素對(duì)丁酸梭菌無抑制作用；25 mg/kg和50 mg/kg 吉他霉素具有較強(qiáng)的抑制作用，75 mg/kg吉他霉素的抑制作用極強(qiáng)；不同濃度喹烯酮、鹽酸金霉素、土霉素鈣以及阿莫西林對(duì)丁酸梭菌均顯示極強(qiáng)的抑制作用。

圖3 不同抗生素對(duì)丁酸梭菌的抑制作用

圖4 及表4 表明，不同濃度的桿菌肽鋅、喹烯酮、硫酸新霉素、硫酸粘桿菌素均對(duì)糞腸球菌無抑制作用；25 mg/kg 吉他霉素有中度抑制作用，但50 mg/kg 和75 mg/kg吉他霉素有較強(qiáng)的抑制作用；3 個(gè)不同濃度的阿莫西林有較強(qiáng)的抑制作用；所用不同濃度鹽酸金霉素以及土霉素鈣對(duì)糞腸球菌抑制作用極強(qiáng)。

表3 不同抗生素對(duì)丁酸梭菌抑制作用的測(cè)定結(jié)果 mm

圖4 不同抗生素對(duì)糞腸球菌的抑制作用

表4 不同抗生素對(duì)糞腸球菌抑制作用的測(cè)定結(jié)果 mm

圖5 表明，試驗(yàn)所用的不同濃度的抗生素類物質(zhì)，包括桿菌肽鋅、喹烯酮、吉他霉素、鹽酸金霉素、土霉素鈣、阿莫西林、硫酸新霉素以及硫酸粘桿菌素對(duì)酵母菌均有抑菌作用。

3 討 論

圖5 不同抗生素對(duì)酵母菌的抑制作用

抗生素長期以來一直用于動(dòng)物生產(chǎn)，以提高生產(chǎn)性能，預(yù)防疾病的發(fā)生，但抗生素在大量使用的同時(shí)也帶來一系列弊端，如動(dòng)物胃腸道正常菌群失調(diào)、耐藥性和藥物殘留等。研究表明，益生菌可通過調(diào)節(jié)腸道菌群進(jìn)而提高畜禽自身免疫力，或是改善抗生素使用后帶來的一系列腸道菌群失調(diào)的癥狀，可部分或全部替代抗生素[9]。王二柱等[10]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酪桿菌與糞腸球菌按照4:1:4:1 組合與低劑量的金霉素配合，可達(dá)到高濃度金霉素的抑菌效果。Wang 等[11]研究也表明，與金霉素相比，益生菌制劑提高動(dòng)物免疫力的效果更好。

有研究表明，丁酸梭菌具有很強(qiáng)的耐受性，對(duì)常用的抗生素藥物，包括桿菌肽鋅、青霉素、鏈霉素等在內(nèi)的多種抗生素不敏感[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的桿菌肽鋅及硫酸粘桿菌素對(duì)包括丁酸梭菌在內(nèi)的5 種常用益生菌對(duì)均無抑菌作用。硫酸粘桿菌素則主要對(duì)革蘭氏陰性菌（尤其大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、變形桿菌和嗜血桿菌等）有強(qiáng)抑制作用，用于治療革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病。劉超齊等[13]研究顯示，飼料中添加 300～400 mg/kg 硫酸粘桿菌素會(huì)對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)添加劑量低于200 mg/kg 時(shí)，則對(duì)枯草芽孢桿菌無抑制作用。甄麗等[14]研究表明，乳酸菌對(duì)常規(guī)用量濃度的硫酸粘桿菌素、土霉素等抗生素的敏感性不強(qiáng)。鄔向東等[15]研究顯示，乳酸糞腸球菌對(duì)桿菌肽鋅及硫酸黏桿菌等抗生素有較強(qiáng)的耐受作用，其最小抑菌濃度分別達(dá)到了2 560、160 mg/kg。本試驗(yàn)所用的糞腸球菌屬于乳酸菌中的一類，結(jié)果表明不同濃度的桿菌肽鋅、喹烯酮、硫酸新霉素、硫酸粘桿菌素均對(duì)糞腸球菌無抑菌作用。同時(shí)，馮柳柳等[16]研究表明，對(duì)比于單個(gè)菌株，乳球菌、乳桿菌、枯草芽孢桿菌3 種菌株的混合使用提高了其對(duì)硫酸新霉素與硫酸粘桿菌素的耐受性。酵母菌屬于真菌，其對(duì)大多數(shù)抗生素（如氨芐青霉素，鏈霉素，新霉素等）不敏感[17-18]，啤酒酵母也能夠耐受飼料中添加的抗生素[13]，說明抗生素的使用不影響酵母菌的生物活性。本研究結(jié)果顯示，喹烯酮、吉他霉素、土霉素鈣等8 種抗生素均對(duì)酵母菌無抑制作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的吉他霉素、阿莫西林以及硫酸新霉素均對(duì)枯草芽孢桿菌顯示出極強(qiáng)的抑制作用；50 mg/kg 吉他霉素及75 mg/kg 硫酸新霉素對(duì)地衣芽孢桿菌有著極強(qiáng)的抑制作用；75 mg/kg 吉他霉素、不同濃度喹烯酮、鹽酸金霉素、土霉素鈣以及阿莫西林對(duì)丁酸梭菌的抑制作用極強(qiáng)；不同濃度鹽酸金霉素以及土霉素鈣對(duì)糞腸球菌抑菌作用極強(qiáng)。為了更好發(fā)揮益生菌制劑的作用，在畜禽飼養(yǎng)過程應(yīng)避免與能破壞益生菌制劑活性的抗生素共同使用，以減少抗生素對(duì)益生菌的影響。