陳麗玲 ，鄒田德，賀 琴，郭曉波，盧亞飛，羅波文，王自蕊*，游金明*

（1.江西農業(yè)大學動物科技學院，江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，江西省優(yōu)質安全畜禽生產(chǎn)產(chǎn)教融合重點創(chuàng)新中心，江西南昌 330045；2.江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心，江西南昌 330004）

腸道既是營養(yǎng)物質消化吸收的主要場所，也是防御腸道病原菌等有害物質入侵的重要屏障。腸道絨毛結構異常和屏障功能損傷是導致斷奶仔豬腹瀉的關鍵內在因素[1]。因此，維持仔豬腸道形態(tài)和正常的屏障功能是促進仔豬健康生長的基本保證。仔豬早期斷奶會導致小腸絨毛變短、隱窩加深、絨毛高度與隱窩深度之比（V/C）下降，從而降低飼料養(yǎng)分的消化利用率。未消化的養(yǎng)分在腸道堆積后將使腸道內滲透壓增加，引發(fā)腹瀉。同時，后腸段中有害菌和腐敗菌增殖劇增，進一步加劇腸絨毛結構與功能的損傷[2]。仔豬小腸上皮細胞間良好的緊密連接結構是離子和氨基酸類營養(yǎng)物質選擇性通過小腸黏膜的前提。仔豬斷奶將下調腸上皮細胞間緊密連接蛋白的表達量，導致上皮細胞間緊密連接結構受損，進而提高腸道通透性、增加有害微生態(tài)入侵的幾率。Ala-Gln[3]、丁酸梭菌[4]、啤酒酵母提取物[5]、酵母壁多糖[6]等功能性添加劑可以有效改善腸道形態(tài)結構、提高腸道屏障功能。而在目前飼料中全面禁止使用抗生素的背景下，以中草藥作為替抗產(chǎn)品來改善仔豬腸道健康的研究逐漸成為熱點。臨床醫(yī)學上證實，由白術茯苓（1:1）配比的中藥復方可以治療人的腹瀉型腸道疾病，但在仔豬上鮮有報道。本研究小組在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加0.02%、0.04%、0.06%的白術茯苓多糖復方能顯著提高仔豬的平均日增重，并降低斷奶仔豬的耗料增重比，0.06%白術茯苓多糖還可有效降低仔豬的腹瀉頻率?；诖?，本研究旨在進一步探討白術茯苓多糖復方對仔豬腸道形態(tài)及腸上皮細胞緊密連接結構的調節(jié)作用，以掌握白術茯苓多糖復方促進仔豬生長、改善腸道健康的作用機制，為指導白術茯苓多糖復方在仔豬飼料中的科學應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 白術多糖（AtractylodesMacrocephalaon Polysaccharide，AMP）和茯苓多糖（Poriacocos polys accharide，PCP）由四川恒瑞通達生物科技有限公司提供，多糖含量均為37.5%，剩余部分為糊精。白術多糖和茯苓多糖在使用前按照1:1 預先混合后待用。

1.2 試驗設計 選取150 頭遺傳背景一致、健康狀況良好、體重（7.14±0.22）kg 的23 日齡杜×長×大斷奶仔豬，按照完全隨機設計方法分為6 組，每組5 個重復，每個重復5 頭豬。空白組飼喂基礎日糧，抗生素組在基礎日糧中添加硫酸粘桿菌素20 mg/kg+桿菌肽40 mg/kg+喹乙醇100 mg/kg，4 個試驗組分別在基礎日糧中添加0.02%、0.04%、0.06% 和0.08% 白術茯苓多糖復方。基礎飼糧是參考NRC（2012）和我國《豬飼養(yǎng)標準》（2004）配制成的玉米-豆粕型日糧（表1）。試驗于2016 年11—12 月在江西省某牧業(yè)有限公司養(yǎng)豬場進行，試驗期27 d。仔豬飼養(yǎng)于裝有高床、漏縫地板、乳頭式飲水器的保育舍，舍內溫度控制為23～25℃、相對濕度為65%～75%。試驗開始前對豬舍徹底清理、清洗、消毒。試驗過程中，每日飼喂4～5 次。所有仔豬自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理措施、免疫處理按豬場常規(guī)管理程序進行。

1.3 樣品采集及處理 試驗結束當天，從每個重復中隨機選取1 頭體重接近平均體重的仔豬，前腔靜脈采集血10 mL 于真空抗凝采血管中。3 000 r/min 離心10 min，分裝后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 腸段樣品采集 試驗結束時，從每個重復中隨機選取1 頭仔豬，肌注 4%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉。待麻醉完全后，頸靜脈放血處死，沿腹中線剖開腹腔，剪取十二指腸、空腸、回腸中段各3～5 cm。用生理鹽水小心沖洗腸道內食糜，而后用干凈濾紙輕輕吸干腸道表面水分。將腸道一端結扎后，置于4%甲醛溶液中固定24 h 以上，用于制作石蠟切片。

1.3.2 腸道黏膜樣品采集 用無菌手術剪剪取空腸和回腸中段各約6 cm。用鑷子輕輕擠出腸道內容物，并將冷DEPC 處理水灌入腸腔，小心沖洗腸內容物。沿腸段縱軸剪開腸壁，經(jīng)干凈濾紙吸水后，用載玻片小心刮取小腸黏膜，分裝于2 mL 無菌凍存管中，編號后立即放入液氮中速凍，最后轉入-80℃保存，待后續(xù)提取總RNA 和總蛋白。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 腸道通透性 血漿D-乳酸（D-Lactace）、二胺氧化酶（DAO）含量使用全波長多功能酶標儀（Thermo，Massachusetts，America）測定，具體操作按照血漿D-Lactace ELISA 試劑盒（K667-100，美國BioVision）和DAO ELISA 試劑盒（SBJ-Z051，南京森貝伽生物科技有限公司）說明書執(zhí)行。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)成分（風干基礎）

1.4.2 腸道形態(tài)結構 取出4% 甲醛溶液固定的腸道組織，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、H.E.染色后，利用Motic Images Advanced 3.2 軟件，測量腸道隱窩深度和絨毛高度，每張切片觀察10 個視野。計算絨毛高度/隱窩深度（V/C）。

1.4.3 小腸上皮細胞緊密連接蛋白及相關基因CDKN1A和p53 表達水平 根據(jù)GenBank 提供的豬基因序列，用PrimerExpress 5.0 軟件設計ZO-1、Occludin、Claudin-1、CDKN1A及p53的基因特異性擴增引物。引物序列見表2，引物由上海生物工程有限公司合成。參考肖定福[7]方法提取空腸黏膜總RNA。以GAPDH為內參（F：5'-GAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3'、R：5'-CATGGGTAGAATCATACTGGAACA-3'），按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 反轉錄試劑盒說明進行反轉錄反應。以反轉錄產(chǎn)物為模板使用定量PCR（CFX96，美國伯樂）進行基因擴增，以測定空腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA以及CDKN1A和p53的相對表達量。另取空腸黏膜樣，用裂解液裂解，采用BCA 法測定總蛋白濃度并將蛋白濃度調至一致。經(jīng)過PAGE 分離后，將蛋白轉移至PVDF 膜上，室溫下用5% 脫脂奶粉封閉1 h，分別用兔抗Actin（ab8226，Abcam）、兔抗ZO-1（BS-1239R，北京博奧森生物技術有限公司）、Occludin（BS-10011R，北京博奧森生物技術有限公司）、Claudin-1（BS-13739R，北京博奧森生物技術有限公司）抗體和HRP 標記的羊抗兔抗體（ab6789，Abcam）孵育，以通過Western blot 法檢測空腸黏膜ZO-1、Occludin 和Claudin-1 蛋白的表達量。

1.5 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)用Excel2013 簡單處理后，采用SPSS17.0 軟件中單因素方差分析（One-Way ANOVA）模型進行方差分析，Duncan'S 法多重比較，各組數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。以P＜0.05 為顯著性判斷標準。

表2 實時熒光定量PCR 引物序列

2 結果與分析

2.1 白術茯苓多糖復方對斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)結構的影響 如表3 所示，與抗生素組和空白組相比，飼糧中添加白術茯苓多糖復方能顯著增加十二指腸、空腸和回腸絨毛高度，尤其是0.06%組增加最顯著；各組間十二指腸隱窩深度差異不顯著；抗生素組和0.04%、0.06%白術茯苓多糖復方組的空腸隱窩深度顯著低于空白組；0.06%白術茯苓多糖復方組仔豬十二指腸的V/C 值顯著高于0.02%、0.04%、0.08%白術茯苓多糖及抗生素組，但0.08% 白術茯苓多糖復方組仔豬的空腸、回腸V/C顯著低于抗生素組；0.02%、0.04%、0.06% 白術茯苓多糖組仔豬十二指腸、空腸、回腸V/C 顯著高于空白組，且隨飼料中白術茯苓多糖添加量增加，V/C 呈逐漸升高趨勢，但添加量達到0.08%時，十二指腸、空腸、回腸V/C 回落至與空白組無顯著差異的水平。

2.2 白術茯苓多糖復方對斷奶仔豬腸道通透性的影響由表4 可知，與抗生素組和空白組相比，飼糧添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08% 白術茯苓多糖復方能顯著降低血漿D-Lactate 和DAO 含量，且隨著白術茯苓多糖復方添加量的增加呈先降低后回升的趨勢（P＜0.05）。

2.3 白術茯苓多糖復方對斷奶仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白基因表達量的影響 如圖1 所示，與抗生素組和空白組相比，飼糧中添加0.04%、0.06%和0.08%白術茯苓多糖復方能顯著增加仔豬空腸黏膜ZO-1和Claudin-1mRNA 的相對表達量；0.04%和0.06%白術茯苓多糖復方能顯著增加仔豬空腸黏膜OccludinmRNA 的相對表達量。隨著白術茯苓多糖添加量的增加，ZO-1、OccludinmRNA 的相對表達量呈復方先增加后降低的趨勢。

如圖2 所示，飼糧中添加白術茯苓多糖復方對空腸黏膜ZO-1、Claudin-1 蛋白表達沒有顯著影響；Occludin 蛋白相對表達量趨勢更為明顯，當白術茯苓多糖復方添加量達0.06% 和0.08% 時，Occludin 蛋白相對表達量顯著低于抗生素組，0.08%白術茯苓多糖復方組的Occludin 蛋白相對表達量顯著低于空白組。

2.4 白術茯苓多糖對斷奶仔豬空腸黏膜CDKN1A和p53mRNA 表達量的影響 由圖3 可知，與抗生素組、空白組相比，飼糧中添加0.04%、0.06%、0.08% 白術茯苓多糖復方能顯著提高仔豬空腸黏膜CDKN1AmRNA的相對表達量；各組間仔豬空腸黏膜p53mRNA 相對表達量則差異不顯著。

表3 白術茯苓多糖復方對斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)結構的影響

表4 白術茯苓多糖復方對斷奶仔豬腸道通透性的影響

圖1 白術茯苓多糖復方對仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

圖2 白術茯苓多糖復方對仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白的影響

3 討 論

圖3 白術茯苓多糖復方對仔豬空腸黏膜CDKN1A 和p53 mRNA 表達量的影響

研究表明，白術和茯苓多糖對調節(jié)動物的腸道形態(tài)結構有積極作用，如參苓白術多糖可緩解雨蛙素誘導的急性胰腺炎大鼠的小腸黏膜絨毛的損傷程度[8]，使大腸桿菌引起的腹瀉小鼠十二指腸絨毛形態(tài)恢復正常[9]，還能治療小鼠的脾虛泄瀉，使小鼠腸上皮絨毛結構完整、脫落較少，且腸黏膜固有層、間質無明顯水腫[10]。本試驗結果表明，飼糧添加白術茯苓多糖復方能顯著增加仔豬小腸絨毛高度，提高V/C；但添加量達0.08%時，十二指腸、空腸、回腸V/C 回落至與空白組無顯著差異的水平。

腸道屏障結構的完整是腸道正常發(fā)揮吸收功能的重要基礎之一。當腸道屏障受損時，腸道的通透性增大[3,11]。臨床上常用參苓白術散來治療功能性腹瀉，藥方中人參、白術、茯苓三者為君藥，功能是補益脾氣、滲濕止瀉，且白術和茯苓比例是1:1。采用參苓白術散輔助治療患者的血清DAO 低于西藥常規(guī)治療者[9]。參苓白術散（藥方中人參、茯苓、白術為主，且白術茯苓比例為1:1）中、高劑量組使脾虛泄瀉幼鼠血漿D-Lactate 和DAO 水平顯著降低，說明中、高劑量參苓白術散可降低腸黏膜的通透性，保護腸黏膜屏障[12]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，斷奶應激常常造成仔豬腸道黏膜屏障損傷，進而增加腸道的通透性。本研究結果發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加白術茯苓多糖能顯著降低血漿D-Lactate 和DAO 活性，且隨著白術茯苓多糖添加量的增加呈先降低后有所回升的趨勢。仇瑞莉等[9]和黃玉珍[12]的研究也表明，適量的白術茯苓多糖復方能緩解斷奶應激對仔豬腸道黏膜的損傷，降低腸黏膜的通透性。但本研究結果顯示，白術茯苓多糖添加量過大可能會對腸黏膜通透性產(chǎn)生不利影響。

腸上皮細胞間的緊密連接結構與腸道物理屏障功能與有密切相關性，保證腸道有效的緊密連接對維持腸上皮細胞極性和防止上皮細胞間隙中的物質溢出都起著重要作用[13-14]。Occludin 蛋白集中在細胞緊密連接纖維內，其完好性關系著緊密連接的完整性，而ZO-1 蛋白一旦被破壞，細胞的緊密連接會隨之發(fā)生改變。劉海萍等[15]認為，仔豬早期斷奶會破壞腸道黏膜結構，增加腸道通透性，可能是由上皮細胞緊密連接蛋白Occludin表達下降所引起。Troeger 等[16]依據(jù)患者十二指腸病樣Claudin-4 和Claudin-7 不表達，Claudin-2 弱表達，而Claudin-1 表達顯著減少，推測Claudin-1 表達降低引起緊密連接功能受損，并導致水和離子漏到腸腔內，從而引起腹瀉。本研究結果顯示，飼糧中添加0.04%、0.06% 白術茯苓多糖復方能顯著增加仔豬空腸黏膜ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA 的相對表達量，且隨著白術茯苓多糖添加量的增加，ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA 相對表達量呈先增加后降低的趨勢，說明白術茯苓多糖能提高斷奶仔豬空腸黏膜的緊密連接性，從而改善斷奶仔豬腸道健康。但用Western blot 法檢測空腸黏膜ZO-1、Occludin 和Claudin-1 蛋白表達時，結果顯示ZO-1 和Claudin-1 蛋白表達各組間差異并不顯著，推測可能是由于蛋白的表達與mRNA 的表達存在時間差。

腸黏膜受損后，腸上皮細胞會參與傷口愈合的過程，該過程主要依賴傷口附近區(qū)域上皮細胞的遷移、增殖和分化之間的平衡。CDK 抑制因子、細胞周期蛋白及其依賴性激酶作為細胞周期調控因子，發(fā)揮著調控細胞周期的作用，而p21/CDKN1A 主要是通過調控CDKs 活性參與細胞周期的調控；但p21/CDKN1A 是p53 的靶基因，其表達水平受p53 的轉錄調控，參與由p53 介導的細胞DNA 損傷反應；當細胞損傷時，p53啟動p21/CDKN1A 的表達，p21/CDKN1A 抑制cyclin/CDK 活性，使細胞停滯于Gl 期[17]。p21/CDKN1A 在體內外通常被認為具有抑制細胞增殖的作用，而正常野生型p53 活化后可抑制細胞的增殖、調控細胞周期、誘導細胞分化、細胞調亡等。同時，p21/CDKN1A 高表達可阻止細胞凋亡發(fā)生，這與p21/CDKN1A 能促使細胞周期阻滯，繼而防止DNA 損傷或促進其修復有關[18]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，與抗生素組、空白組相比，飼糧中添加0.04%、0.06%、0.08% 白術茯苓多糖復方能顯著提高仔豬空腸黏膜CDKN1A 相對表達量，各組間仔豬空腸黏膜p53 mRNA 相對表達量則差異不顯著，說明適量的白術茯苓多糖復方可通過調控CDKN1A基因的表達來抑制空腸上皮細胞的凋亡，促進其修復，但該調控途徑可能屬于非p53 依賴型。

4 小 結

本研究結果表明，白術茯苓多糖復方能有效改善斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)結構，維持腸道正常的通透性，白術茯苓多糖的適宜添加量為0.06%；白術茯苓多糖復方能改善斷奶仔豬小腸屏障功能，通過調控CDKN1A基因的表達來抑制空腸上皮細胞的增殖，并促進空腸黏膜ZO-1、Claudin-1和OccludinmRNA 的表達。