紀(jì)昌正 ，田俊杰，朱哲坤，王 倩，孟禹璇，李寶成，王 蕾,2，侯永清,2*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023）

隨著我國(guó)畜牧業(yè)的快速發(fā)展以及人民生活水平的提高，人們對(duì)畜產(chǎn)品的要求也不斷提高，豬的瘦肉（肌肉）質(zhì)量受到廣泛關(guān)注。功能性氨基酸對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝等生命活動(dòng)發(fā)揮著重要的生理作用[1]。谷氨酸（Glutamate，Glu）參與調(diào)控機(jī)體其他氨基酸的代謝，對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)和免疫功能等方面起著重要作用，是動(dòng)物最佳生長(zhǎng)和健康所必需的一種氨基酸[2]。谷氨酰胺（Glutamine，Gln）可以促進(jìn)血清蛋白的合成并提高肌肉組織的抗氧化能力[3]。精氨酸（Arginine，Arg）可促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)合成及抑制其降解，適宜的精氨酸需要量能夠促進(jìn)新生仔豬的生長(zhǎng)[4]。Powell 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸（Glycine，Gly）能夠提高仔豬的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，對(duì)仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。另外，甘氨酸還是一種有效的抗氧化劑，可清除體內(nèi)自由基，提高機(jī)體免疫力[6]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）對(duì)刺激引起的肌肉能量消耗具有緩解作用[7]。

功能性氨基酸作為合成多種具有重要功能生物活性分子的必需前體物，參與調(diào)節(jié)動(dòng)物的新陳代謝途徑，對(duì)維持動(dòng)物正常的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于各種功能性氨基酸的報(bào)道已有很多，但將多種功能性氨基酸按一定比例制成復(fù)合物，對(duì)仔豬肌肉生長(zhǎng)影響的相關(guān)報(bào)道還很少。前期研究表明，添加1.0% 復(fù)合氨基酸可顯著降低仔豬腹瀉率，對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能無顯著影響[9]。本試驗(yàn)旨在研究復(fù)合氨基酸對(duì)仔豬背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用谷氨酸（G103978，99%）、谷氨酰胺（G105425，99%）、精氨酸（A108220，98%）、甘氨酸（A111465，≥99%）、N-乙酰半胱氨酸（A105420，99%）為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品。

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定了復(fù)合氨基酸的組成和比例，即復(fù)合氨基酸按谷氨酸:谷氨酰胺:甘氨酸:精氨酸:N-乙酰半胱氨酸為5:2:2:1:0.5 的比例混合制成。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)選用16 頭24 日齡體重（5.49±0.35）kg、健康杜× 長(zhǎng)× 大斷奶仔豬，隨機(jī)分為對(duì)照組和復(fù)合氨基酸組，每組8 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 頭豬。各組基礎(chǔ)日糧一致，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.99%的丙氨酸（等氮控制），復(fù)合氨基酸組飼喂基礎(chǔ)日糧+1.0%的復(fù)合氨基酸，試驗(yàn)期為21 d。

1.3 試驗(yàn)日糧 基礎(chǔ)日糧參照NRC（2012）豬的營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制，日糧的組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理 豬舍為全封閉式，進(jìn)豬前對(duì)豬舍及豬籠徹底清洗豬舍并消毒。仔豬飼養(yǎng)在不銹鋼試驗(yàn)籠中，試驗(yàn)期間保持豬舍通風(fēng)良好，維持室溫在22～25℃；由鴨嘴式飲水器供水；每天飼喂5 次，分別在8:00、12:00、15:00、18:00、22:00 飼喂，保證自由采食，自由飲水；每天清掃豬舍1 次，每天用消毒液進(jìn)行圈舍消毒。

1.5 樣品采集 于試驗(yàn)第21 天，待所有仔豬完全麻醉后屠宰。將背部皮膚剖開，取中間段背最長(zhǎng)肌，剪成小塊分裝在凍存管中，立即裝入紗布袋放入液氮中凍存，再轉(zhuǎn)至-80℃保存待測(cè)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1 背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)指標(biāo) 用John Chandler 法[10]提取組織勻漿液中的DNA 和RNA，用紫外吸收法測(cè)定提取液中RNA 和DNA 水平?？偟鞍诇y(cè)定方法參照試劑（南京建成生物工程研究所）所附說明書。

1.6.2 背最長(zhǎng)肌游離氨基酸含量 采用德國(guó)SYKAM S-433D 型氨基酸分析儀檢測(cè)背最長(zhǎng)肌游離氨基酸含量。

1.6.3 背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 采用TRIzo（lTaKaRa，大連）一步抽提法，提取背最長(zhǎng)肌研磨樣品中的總RNA，在保證RNA 純度合格（A260/A280=1.7～2.1，且A260/A230＞2）且未降解的前提下，根據(jù)PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）試劑盒的方法步驟對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，然后再采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的方法，以RPL4基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行檢測(cè)。各個(gè)基因qPCR 的數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)一參照Fu 等[11]的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)的基因序列見表2。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.1 為具有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合氨基酸對(duì)背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)的影響 從表3 可以看出，與對(duì)照組相比，復(fù)合氨基酸組提高了背最長(zhǎng)肌蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)/DNA（P＜0.05），降低了RNA/DNA（P＜0.05）；有降低RNA 含量的趨勢(shì)（P＜0.1），其他指標(biāo)差異不顯著。

2.2 復(fù)合氨基酸對(duì)仔豬背最長(zhǎng)肌游離氨基酸的影響 從表4 可以看出，與對(duì)照組相比，復(fù)合氨基酸組顯著提高了背最長(zhǎng)肌纈氨酸、組氨酸、3-甲基組氨酸和精氨酸的含量（P＜0.05）；降低了背最長(zhǎng)肌蘇氨酸、谷氨酰胺、β-丙氨酸、賴氨酸和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量（P＜0.05）；其他氨基酸含量差異不顯著。

表2 檢測(cè)基因的引物序列

表3 復(fù)合氨基酸對(duì)背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)的影響

2.3 復(fù)合氨基酸對(duì)背最長(zhǎng)肌相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響由表5 可知，與對(duì)照組相比，復(fù)合氨基酸組顯著上調(diào)了仔豬背最長(zhǎng)肌PepT1和b0,+AT基因的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05），顯著下調(diào)了仔豬背最長(zhǎng)肌MSTN基因的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）；其他基因的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。

3 討 論

3.1 復(fù)合氨基酸對(duì)肌肉組織生長(zhǎng)的影響 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的重要承擔(dān)者，影響各種酶的合成、細(xì)胞生長(zhǎng)等。DNA 濃度、RNA/DNA 比值和蛋白質(zhì)/DNA 比值可以說明細(xì)胞的發(fā)育、代謝情況等，可用于評(píng)估肌肉生長(zhǎng)情況[12]。DNA 濃度反映有絲分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞的速度，RNA/DNA 比值可以衡量細(xì)胞的增長(zhǎng)速率，蛋白質(zhì)/DNA比值表示細(xì)胞中蛋白合成的效率[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合氨基酸組背最長(zhǎng)肌蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)/DNA顯著升高，說明添加復(fù)合氨基酸可以促進(jìn)背最長(zhǎng)肌細(xì)胞的蛋白合成，代謝加快。大量研究表明，谷氨酰胺、精氨酸、甘氨酸和N-乙酰半胱氨酸可以通過mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)蛋白的合成，谷氨酸和精氨酸的代謝產(chǎn)物多胺對(duì)DNA 和蛋白的合成有重要作用[15-19]。這表明復(fù)合氨基酸對(duì)背最長(zhǎng)肌的合成有促進(jìn)作用。

表4 復(fù)合氨基酸對(duì)仔豬背最長(zhǎng)肌游離氨基酸的影響

表5 復(fù)合氨基酸對(duì)背最長(zhǎng)肌相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

3.2 復(fù)合氨基酸對(duì)背最長(zhǎng)肌游離氨基酸含量的影響 本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加復(fù)合氨基酸顯著提高了背最長(zhǎng)肌精氨酸水平，提示復(fù)合氨基酸可能會(huì)影響機(jī)體腎臟功能或蛋白質(zhì)代謝。對(duì)仔豬來說，精氨酸是一種必需氨基酸，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)和免疫有重要作用[20]。研究表明，支鏈氨基酸中的纈氨酸是豬必需氨基酸，對(duì)機(jī)體代謝有著重要的生物學(xué)作用。纈氨酸是生長(zhǎng)肥育豬肌肉蛋白質(zhì)合成的必需氨基酸[21]。組氨酸是可以組成蛋白組結(jié)構(gòu)的一種含有咪唑雜環(huán)的氨基酸，參與機(jī)體蛋白質(zhì)合成，還是生理活性物質(zhì)的成分，具有清除細(xì)胞內(nèi)氧化物和參與免疫調(diào)節(jié)作用等[22]。本試驗(yàn)研究表明，添加復(fù)合氨基酸可以提高背最長(zhǎng)肌纈氨酸、組氨酸、3-甲基組氨酸的含量，表明復(fù)合氨基酸通過調(diào)節(jié)背最長(zhǎng)肌氨基酸水平從而促進(jìn)背最長(zhǎng)肌的生長(zhǎng)。

3.3 復(fù)合氨基酸對(duì)背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因表達(dá)量的影響 本試驗(yàn)研究表明，添加復(fù)合氨基酸顯著提高了背最長(zhǎng)肌PepT1基因的相對(duì)表達(dá)量。Shiraga 等[23]的研究亦表明，日糧中二肽和游離氨基酸濃度增加，PepT1基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，其對(duì)二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)活性增強(qiáng)，進(jìn)而使PepT1在細(xì)胞膜上的表達(dá)增多。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體b0,+AT在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)吸收中有著重要作用。有研究表明，斷奶仔豬日糧中添加精氨酸，b0,+AT表達(dá)增加，小腸內(nèi)精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)吸收能力增強(qiáng)，從而對(duì)緩解仔豬斷奶應(yīng)激和促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)起到一定作用[24]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，添加復(fù)合氨基酸可顯著上調(diào)b0,+AT基因的表達(dá)量，說明復(fù)合氨基酸通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝相關(guān)的基因表達(dá)促進(jìn)背最長(zhǎng)肌的氨基酸代謝，進(jìn)而影響背最長(zhǎng)肌的生長(zhǎng)。肌肉生長(zhǎng)抑制素（Myosmfin，MSTN）基因也稱GDF-8（Growth And Different-Tiation Factor 8）基因是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的成員，是骨骼肌生長(zhǎng)的抑制因子[25]，它通過抑制MyoD家族成員轉(zhuǎn)錄活性來抑制肌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)量與肌肉重量的變化呈負(fù)相關(guān)[26]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，添加復(fù)合氨基酸組仔豬背最長(zhǎng)肌MSTN基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，表明復(fù)合氨基酸通過降低肌肉生長(zhǎng)抑制因子的表達(dá)促進(jìn)背最長(zhǎng)肌的生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

復(fù)合氨基酸可以促進(jìn)背最長(zhǎng)肌蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)氨基酸代謝，抑制肌肉生長(zhǎng)抑制因子的表達(dá)，對(duì)斷奶仔豬背最長(zhǎng)肌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。