邱伯雍，魏易洪，曹 敏，毛美嬌，吳 瓊，周 端，湯 諾，唐靖一

人參皂苷是人參的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等廣泛而復(fù)雜的藥理作用[1]。諸多研究表明人參皂苷對(duì)心臟相關(guān)疾病有明顯改善作用[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，作為皂苷類成分之一的人參皂苷Rb3亦可通過(guò)激活抗氧化信號(hào)通路[4]、改善心肌缺血[5-6]、抑制細(xì)胞凋亡[7]等途徑保護(hù)心肌細(xì)胞。在心血管疾病中，活性氧的產(chǎn)生對(duì)心肌和血管具有重要作用[8]。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧可引起心肌細(xì)胞凋亡，心臟功能障礙，導(dǎo)致心功能下降[9]。過(guò)氧化氫(H2O2)作為氧化應(yīng)激的外源性誘導(dǎo)因子，是研究諸多藥物抗心肌氧化損傷、凋亡等的常用模型[10-12]。但人參皂苷Rb3在氧化損傷過(guò)程中對(duì)心肌細(xì)胞的作用及機(jī)制的研究報(bào)道不多。故本研究擬采用H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2建立氧化損傷模型，檢測(cè)人參皂苷Rb3對(duì)該模型中缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的mRNA表達(dá)作用，同時(shí)使用磷酯酰激醇3-激酶(PI3K)抑制劑LY294002(LY294)，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞株H9c2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物與試劑 人參皂苷Rb3購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST14072211；30%H2O2、氯仿、異丙醇、乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PI3K抑制劑LY294購(gòu)自碧云天生物工程有限公司；Trizol Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Roche公司；ROX購(gòu)自Roche公司；焦碳酸乙二酯購(gòu)自Sigma公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購(gòu)自HyClone公司。

1.3 儀器 Applied Biosystems 7900HT熒光定量PCR儀購(gòu)自Funglyn Biotech公司；低溫高速離心機(jī)、移液器、微型離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；-20 ℃冰箱購(gòu)自青島海爾股份有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 H9c2細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞長(zhǎng)到約80%融合時(shí)使用0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代，平均約3 d傳一代。

1.4.2 溶液制備 將人參皂苷Rb3溶解在二甲基亞砜(DMSO)中配制成100 mmol/L儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱，臨用時(shí)以培養(yǎng)液稀釋制成25 μmol/L的藥液。取30% H2O2溶液適量，以培養(yǎng)液稀釋制成400 μmol/L的溶液，即用即配。

1.4.3 給藥及分組 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞接種于6個(gè)5 cm培養(yǎng)皿內(nèi)(2.0×105個(gè)/mL)，在10% DMEM培養(yǎng)液、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換為0.5%DMEM培養(yǎng)液，設(shè)立空白對(duì)照組、Rb3組、Rb3+LY294組、H2O2組、H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組。在人參皂苷 Rb3處理前30 min加入30 μmol/L LY294，25 μmol/L Rb3預(yù)處理24 h后，加入400 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡1 h、2 h后，各組進(jìn)行熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(real time PCR，RT-PCT)檢測(cè)。

1.5 RT-PCR反應(yīng) 采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄法，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA來(lái)合成cDNA；cDNA可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。以Actin為內(nèi)參基因，分別對(duì)HIF-1α、VEGF進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體積為20 μL，利用2-ΔΔCT計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。RT-PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 H2O2作用1 h時(shí)人參皂苷Rb3對(duì)H9c2中HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響 HIF-1α的mRNA表達(dá)情況：與空白對(duì)照組比較，H2O2+Rb3組HIF-1α mRNA明顯升高(P<0.01)，其余組別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Rb3組HIF-1α mRNA明顯升高(P<0.01)，H2O2+Rb3+LY294組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。H2O2+Rb3組與H2O2+Rb3+LY294組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2、圖1A。

VEGF的mRNA表達(dá)情況：與空白對(duì)照組比較，H2O2組、H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組

VEGF mRNA明顯升高(P<0.01)，其余組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組VEGF mRNA明顯升高(P<0.01)。H2O2+Rb3組與H2O2+Rb3+LY294組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2、圖1B。

表2 H2O2作用1 h各組HIF-1α、VEGF的mRNA表達(dá)水平比較(±s)

與空白對(duì)照組比較，＊P<0.01；與H2O2組比較，#P<0.01。

2.2 H2O2作用2 h時(shí)人參皂苷Rb3對(duì)H9c2中HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響 HIF-1α的mRNA表達(dá)情況：與空白對(duì)照組比較，H2O2組、H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組HIF-1α mRNA明顯升高(P<0.01)，其余組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Rb3組HIF-1α mRNA明顯升高(P<0.01)，H2O2+Rb3+LY294組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與H2O2+Rb3組比較，H2O2+Rb3+LY294組HIF-1α mRNA降低(P<0.01)。詳見(jiàn)表3、圖2A。

VEGF的mRNA表達(dá)情況：與空白對(duì)照組比較，H2O2組、H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組VEGF mRNA明顯升高(P<0.01)，其余組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組VEGF mRNA明顯升高(P<0.01)。H2O2+Rb3組與H2O2+Rb3+LY294組VEGF mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3、圖2B。

表3 H2O2作用2 h各組HIF-1α、VEGF的mRNA表達(dá)水平比較(±s)

與空白對(duì)照組比較，＊P<0.01；與H2O2組比較，#P<0.01；與H2O2+Rb3組比較，△P<0.01。

3 討 論

HIF-1α在低氧狀態(tài)下被激活表達(dá)，在缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起著關(guān)鍵作用，是心肌細(xì)胞對(duì)急性缺血和心肌梗死的早期低氧環(huán)境的適應(yīng)性表達(dá)[13]，其靶基因VEGF是參與血管生成的重要信號(hào)蛋白，具有改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)血管再生的功效[14]。研究表明，HIF-1α能夠改善大鼠急性心肌缺血，縮小轉(zhuǎn)基因小鼠心肌梗死面積，增加梗死區(qū)域及其周圍毛細(xì)血管密度，改善心功能[15-16]。VEGF是心肌梗死后的血管生成反應(yīng)的觸發(fā)因子[17]，其亞型VEGF165能夠通過(guò)激活PI3K和Bcl-2通路抗心肌凋亡，縮小心肌梗死面積[18]。在成年小鼠主動(dòng)脈瓣狹窄模型研究中，VEGF可以增加毛細(xì)血管密度，保護(hù)線粒體功能，減少心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，最終保護(hù)心功能[19]。

HIF-1α和VEGF共同參與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程，如吳昊昱等[20]在H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型中發(fā)現(xiàn)大鼠真皮成纖維細(xì)胞在H2O2實(shí)驗(yàn)組(20 μmol/L)中VEGF的表達(dá)量較正常組輕微提高。沈湘波等[21]發(fā)現(xiàn)，H2O2在低濃度(50 μmol/L)時(shí)即可顯著升高支氣管上皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，且具有PI3K通道依賴性。蘇其利等[22]研究H2O2誘導(dǎo)H9c2大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)表明，花旗松素可以激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素氧合酶1(HO-1)/HIF-1α/Autophagy信號(hào)通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組比較，H2O2組中HIF-1α和VEGF的表達(dá)均增加(P<0.01)。表明人參皂苷Rb3能夠上調(diào)HIF-1α及VEGF的表達(dá)，人參皂苷Rb3可能具有保護(hù)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激所致?lián)p傷和凋亡的作用。

LY294是PI3K抑制劑，能抑制蛋白激酶B(Akt)磷酸化。本實(shí)驗(yàn)中，H2O2作用1 h時(shí)，H2O2+Rb3+LY294組HIF-1α的表達(dá)量低于H2O2+Rb3組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)H2O2作用2 h時(shí)，H2O2+Rb3+LY294組HIF-1α的表達(dá)明顯低于H2O2+Rb3組(P<0.01)，表明人參皂苷Rb3上調(diào)HIF-1α可能是通過(guò)PI3K/Akt通路。然而，LY294不能阻斷VEGF的mRNA高表達(dá)，說(shuō)明人參皂苷Rb3可能是通過(guò)其他信號(hào)通路調(diào)節(jié)H2O2模型的VEGF。

心肌細(xì)胞再生能力微弱，各種刺激都會(huì)誘發(fā)不可逆的心肌損傷，故而需要尋求更佳的藥物來(lái)防治心血管疾病。中藥人參擁有補(bǔ)五臟之元、復(fù)脈安神、益智延年之功效，在心血管疾病中運(yùn)用廣泛。本研究對(duì)人參皂苷Rb3干預(yù)H2O2損傷心肌細(xì)胞的作用及機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為中醫(yī)藥防治心血管疾病提供了更多的科學(xué)依據(jù)和思路。